Trichloroethylene의 분해를 위한 soluble methane monooxygenase를 발현하는 재조합 미생물의 제조

장덕진, Thomas K. Wood1

명지대학교 화학공학과, 경기도 용인시 남동 산38-2

Department of Chemical and Biochemical Engineering, University of California, Irvine CA 92717-2575, U. S. A.1

Construction of recombinant bacteria expressing soluble methane monooxygenase for trichloroethylene degradation

Deokjin Jahng and Thomas K. Wood1

Department of Chemical Engineering, Myongji University, Kyungki-Do, Yongin, Nam-Dong 38-2, Korea, and Department of Chemical and Biochemical Engineering, University of California, Irvine, CA 92717-2575, U. S. A.1

서론

Trichloroethylene(TCE)는 주로 금속표면의 기름제거제(degreasing agent)로 사용되는 용제로서, suspected carcinogen (미국 EPA)으로 지정된 난분해성 유해화합물이며(식수내 허용농도: 5 ppb), 지하수 및 토양에서 가장 흔히 검출되는 오염물질이다[1].  우리 나라의 경우에도 일부 상수원 지역에 위치한 폐수 배출시설들은 phenol류 화합물, tetrachloroethylne(PCE) 등과 함께 TCE의 배출을 제한하고 있다 [2].

생물학적인 처리방법은 TCE의 제거시 가장 경제적인 선택이라고 알려져 있으며[3], 호기적으로 TCE를 산화시킬 수 있는 몇 종의 미생물 중 M. trichosporium OB3b의 TCE 분해속도는 450-600 nmol TCE/(min mg protein)로서, 다른 균주의 TCE 분해속도에 비해 최소 50배 이상 높아 주목 받고 있다 [4]. 그러나, M. trichosporium OB3b는 매우 느리게 성장하고 (□max <0.1/hr), TCE 분해의 key enzyme인 sMMO을 유도하기 위해서는 methane이 반드시 존재하여야 하고 (TCE에 대해 competitive inhibition 야기) Cu2+의 농도가 일정 수준 이하 (약 1 □M 이하) 이어야만 하기 때문에, M. trichosporium OB3b를 실용적 목적으로 사용하는 데에는 어려움이 있다 [1].  본 연구의 목적은  이러한 wild type 균주의 문제점들을 제거하기 위하여  M. methylosinus OB3b 유래의 sMMO를 외래 균주에서 발현시키고자 하는 것이다.

재료 및 방법

Plasmid, 균주, 일반 배양조건.  본 연구에 사용된 plasmid,균주, 배지 및 배양온도는 Table 1에 나타내었다.

재조합 plasmid의 제조.  smmo locus가 삽입되어 있는 pDVC202(orfYmmoC)[5]와 pDVC210(mmoXYBZ)[6]으로부터 smmo locus를 연결하여 원래의 sequence대로 복원하였다 (pBE200).  이 pBE200으로부터 smmo locus를 다시 절단, 분리후 pMMB277(Inc-Q derivative)의[7] tac promoter 하에 삽입하여 pSMMO20(Fig.1)를 제조하였다.  유사한 방법으로  pHX200V-47-m1(Inc-P1 derivative)의[8] moxF promoter하에 smmo locus를 cloning하여 pSMMO50를 완성하였다.

smmo locus를 함유하는 재조합 미생물의 제조.  pSMMO20 (pseudomonads, E.coli, Agrobacterium, Rhizobium)나 pSMMO50(methylotrophs와 methanotrophs) 를 세포 내로 주입시키기 위해서는 elctroporation 이나 triparental mating을 이용하였고, plasmid를 소유한 colony 들을 선별하기 위해서는 mmoB에 해당하는 2.1 kb의 DNA probe와 Zenius kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 colony lift hybridization 하였다.

SDS-PAGE 및 Western blotting analysis.  pSMMO20나 pSMMO50를 함유하는 재조합 미생물로부터 smmo가 생산되는지 확인하기 위하여 SDS-PAGE와 Western blotting analysis를 수행하였으며 sMMO 각 component에 대한 항체는 G. Georgiou(U. of Texas, Austin) 교수와 R. Hanson(U. of Minnesota, Minneapolis) 교수로부터 제공되었다.

재조합 미생물의 TCE 분해능 조사.  발현 유도된 재조합 미생물 균체를 phosphate buffer로 2회 세척하고 5 mL (A600=2)을 60 mL serum vial에 넣고 Teflon이 coating된 silicon septum과 aluminum seal로 밀봉하였다. 이들 vial에 TCE를 필요량 주입 후 30oC에서 shaking하며 TCE의 감소여부를 ECD가 장착된 GC를 이용하여 분석하였다 [1]. TCE로부터 유리된 염소이온을 정량하기 위해서는 pH/ion meter와 염소이온 전극을 이용하였다 [1].

결과 및 토론

Table 1에 나타낸 바와 같이 TCE 분해능은 P. putida F1/pSMMO20, A. tumefaciens A114/pSMMO20, R. meliloti102F34/pSMMO20에서만 관찰되었다.  그러나 SDS-PAGE와 Western blot analysis (Fig.2)에 의하면 sMMO protein은 TCE 분해능을 보이지 않은 다른 재조합 균주에서도 생산되었음을 알 수 있었다.	Wild type M. trichosporium OB3b를 환경정화 목적으로 사용하는 데에 가장 큰 걸림돌이었던 sMMO 발현 기작 문제는 재조합 미생물에서는 제거되었다.  Fig.2의 결과는 균체를 IPTG가 함유된 M9-glucose 배지에서 배양하여 얻은 것으로서, sMMO의 발현이 더 이상 methane에 의존하지 않음을 보여주며, Fig.2의 Lane8의 시료는 구리이온이 다량 (10 □M) 함유된 배지에서 배양된 것으로서, 구리이온의 존재 하에서도 sMMO가 생산되었음을 보여주었다.

TCE 분해능을 보인 세 가지 재조합 균주의 TCE 분해속도를 비교했을 때, 큰 차이를 보이지 않았으며, P. putida F1/pSMMO20의 전형적인 TCE 분해 양상은 Fig.3와 같았다.  Initial rates를 double reciprocal plot 하였을 때 vmax는 5 nmol TCE/(min mg protein)으로서 기대에 미치지 못하였으나, 재조합 균주를 사용 시에는 methane의 공급이 필요 없을 뿐 아니라 구리이온의 존재 하에서도 sMMO를 발현시킬 수 있으므로 wild type에 비하여 응용 가능성은 크게 개선되었다고 할 수 있다.  Fig.2의 sample에 대해 염소이온 분석하였을 때, 10, 25 □M TCE의 경우에는 100%의 염소이온 (TCE 1 mole 당 3 mole의 염소이온)이 측정되어 제거된 TCE가 완벽히 분해되었음을 보여 주었으며, 200 □M의 경우에도 약 70%가 완전 분해되었음을 알 수 있었다.  P. putida F1/pSMMO20가 sMMO의 기질 중 하나인 chloroform을[1] 분해하는지도 검토함으로써(Fig.4), 활성이 있는 재조합 sMMO가 생산되었음을 다시 확인할 수 있었다.

sMMO는 TCE 뿐 아니라 많은 종류의 지방족 염소 화합물과 일부의 방향족 화합물을 분해할 수 있다고 알려져 있어, 환경문제의 해결에 중요한 소재가 될 수 있으나 M. trichosporium OB3b의 복잡한 sMMO 발현 조절 기작은 이 균주의 실용적 응용에 여러 가지 제약을 가하고 있다.  본 연구는 유전공학적 방법을 사용하여 이들 문제를 해결하는 방법을 제시하였으며, 향후 재조합 sMMO의 활성을 더욱 증가시키는 연구가 요망된다고 사료된다.

참고문헌

1.	D. Jahng and T. K. Wood. 1994. Appl. Environ. Microbiol. 55: 2819-2826.

2.	환경청 고시 제91-23호

3.	M. J. McFarland et al. 1992. Wat. Res. 26: 259-265.

4.	R. Oldenhuis et al. 1991. Appl. Environ. Microbiol. 57: 7-14.

5.	D. L. N. Cardy et al. 1991. Arch. Microbiol. 156: 477-483.

6.	D. L. N. Cardy et al. 1991. Mol. Microbiol. 5: 335-342.

7.	M. Bagdasarian et al. 1981. Gene. 16: 237-247.

8.	H. M. Xu et al. 1993. J. Gen. Microbiol. 139: 743-752.

Table 1. Bacterial strains and plasmids used in this study.

Strains/plasmids	Media	Antibiotics (□g/mL)a	Temp. (oC)	TCE deg. (recombinant)
Methylotrophs
Methylophilus methylotrophus AS1	MacLennan Minimal (MM)	Tet(2)	37	-
Methylobacterium extorquence AM1	MM	Tet(4)	30	-
Methylobacterium organophilum XX	MM	Tet(15)	30	-
Pseudomonas sp. M27	MM	Tet(10)	30	-
Methanotrophs
Methylocystis parvus OBBP	Higgins minimal (HM)	Tet(15)	30	-
Methylocystis pyriformis #14	HM	Tet(5)	30	-
Other strains
Agrobacterium tumefaciens A114	LB, M9	Cm(80)	30	+
Rhizobium meliloti 102F34	LB, M9	Cm(30)	30	+
Pseudomonads
P. cepacia DBO1	LB, M9	Cm(50)	30	-
P. cepacia G4	LB, M9	Cm(50)	30	-
P. mendocina KR1	LB, M9	Cm(300)	30	-
P. fluorescence	LB, M9	Cm(500)	30	-
P. fragi	LB, M9	Cm(50)	30	-
P. putida KT2440	LB, M9	Cm(500)	30	-
P. putida F1	LB, M9	Cm(500)	30	+
Lab strains
Escherichia coli HB101	LB, M9	Tet(15), Cm(100)	37	-
Plasmids
pBE200		AmpR
pMMB277		CmR
pSMMO20		CmR
pHX200V-m1-47		TetR
pSMMO50		TetR

a Concentrations of antibiotics added to growth media when strains contain plasmids (tetracycline for pSMMO50, chloramphenicol for pSMMO20)

Fig. 1. Restriction map of pSMMO20

Fig. 2 TCE degradation by P. putida

F1/pSMMO20 measured with a GC

Fig.2. Western blot analysis of  sMMO produced in recombinant pseudomonads.

1: MW standards

2: M. trichosporium OB3b

3: P. mendocina KR1/pSMMO20

4: P. mendocina KR1

5: P. putida KT2440/pSMMO20

6: P. putida KT2440

7: P. putida F1/pSMMO20

8: P. putida F1/pSMMO20

(10□M Cu2+)

9: P. putida F1

Fig. 4. Chloroform degradation by

P. putida F1/pSMMO20