AFM을 이용한 광섬유 유기인 바이오센서의 AChE-LB막 특성에 관한 연구

민 준 홍, 정 정 원, 최 현 구, 최 정 우, 이 원 홍

서 강 대 학 교  화 학 공 학 과

Characteristic of AChE-LB Film Using the AFM in Fiber-Optic Organophosphrous Biosensor

Junhong Min, Jung-won Jung, Hyun-Goo Choi, Jeong-Woo Choi and Won Hong Lee

Department of Chemical Engineering, Sogang University

서론

살충제와 농약의 성분인 유기인 화합물은 군사 목적으로 많이 쓰이고 있으며, 유해성이 강하여 소량으로도 인체에 각종 질환과 마비를 가져올 수 있다[1]. 이러한 이유로 유기인 화합물의 측정에 관한 많은 연구가 활발히 진행되어지고 있다[2][3][4]. 개발된 광바이오센서는 유기인 화합물에 의해 직접적으로 저해되는 AChE 효소(Acetylcholinesterase) 의 반응이 용액의 pH 변화를 일으킨다는 원리를 이용하였으며 그 변화를 광으로 측정하였다. 광을 이용하면 원거리 측정이 용이하며 간단한 조작으로도 측정할 수 있다.

본 연구에서는 효소의 활성을 장시간 유지시키기 위하여 LB(Langmuir-  Blodgett)법에 의하여 AChE(효소)를 고정화시켰다. AChE는 viologen 단분자막과의 정전기적인 힘에 의하여 단분자막에 흡착되어진다. 표면구조의 입체적인 정보를 파악할 수 있는 장치인 AFM(Atomic Force Microscopy)을 이용하여 AChE가 고정화되어 있는 LB박막의 표면을 분석하였다[5]. AChE의 LB박막 제작시 필요한 제작조건, 즉, AChE의 양, 누적층수 등이 막의 특성 및 센서신호에 미치는 영향을 조사하였으며, 분자 사이에서의 인력과 척력을 이용한 표면구조 분석 장치인 AFM을 이용하여 AChE가 고정화된 박막의 표면을 분석하여 여러 제작조건에 대한 영향을 확인하였다.

실험

시약

본 연구에서 사용되는 1000U/mg의 활성을 가진 Acetylcholinesterase(EC 3.1.1.7: V-s, from electric eel)와 AChE의 반응물로 쓰이는 Acetylthiocholine iodide그리고  본 연구에서 측정되는 유기인 화합물의 하나인 Paraoxon (diethyl-p-nitrophenylphosphate, E600, liquid, 95% purity)는 미국의 Sigma chemical company (USA)에서 구입하였다. 산-염기 지시약으로 쓰이는 litmus는 BDH laboratory (England)에서 구입하였다. 단분자막을 형성하기 위한 Viologen은 본 연구팀에서 합성되었다.

AChE 고정화

본 연구에서 AChE의 활성을 장시간 유지하기 위하여 Formherz type(Nima Tech., London)의 LB trough을 사용하여 AChE가 고정화된 기판을 제작한다. AChE를 고정화하기 위해서 viologen을 사용하여 수면 위에 단분자막을 형성시킨 후 AChE를 그 단분자막에 정전기적인 힘에 의해 흡착시킨다. AChE가 흡착된 viologen 단분자막은 친수성으로 처리되어진 기판위에 LB기법으로 고정화시킨다. LB trough는 3개의 부분으로 나뉘어져 있으며,  pH 7.0의 용액이 사용된다. 먼저 클로로포름에 viologen을 용해시켜 1mM의 용액을 만든 후 trough의 한 부분에 단분자막을 형성한다. 40분 동안 클로로포름을 증발시킨 후 AChE가 용해되어 있는 부분으로 단분자막을 이동시켜 1시간 동안 단분자막에 AChE를 흡착시킨다.  AChE가 흡착되어진 단분자막은 37mN/m의 표면압으로 압축된 후 기판 위에 누적하기 위하여 이동되어지고 친수성의 기판 위에 누적되어진다. 본 실험에서 친수성으로 처리된 기판 위에 AChE가 흡착된 단분자막을 효과적으로 누적시키기 위해 AChE가 흡착되지 않은 수순한 viologen 단분자막을 먼저 기판 위에 누적시키므로서 친수성 기판을 소수성으로 변화시키며 누적 형태가 z-type인 LB막을 효과적으로 형성할 수 있다. Viologen을 이용한 기판의 소수처리는 LB막 형성시 기판과 단분자막사이에 AChE가 위치하는 것을 막을 수 있으며 누적되는 단분자막의 누적 층수가 증가할수록 감소되는 누적률을 줄일 수 있다.

실험 장치

본 연구의 실험 장치 구성은 그림 1과 같다. 실험 장치는 증류수, 산-염기 지시약과 acetylthiocholine iodide의 혼합 용액 그리고 시료 용액으로 세 종류의 용액을 포함한다. 지시약과 반응물의 혼합 용액에는 180mM의 NaCl과 48□M의 MgSO4  를 AChE 활성을 증가시키기 위해 포함시켰고, 완충 용액으로는 potassium phosphate buffer (pH 7.2)가 사용되었다. 반응기 내에서 AChE가 충분히 반응물과 반응된 후, 증류수는 시료 용액으로 교체된다. 그러면 반응기 내의 AChE는 시료 속의 유기인 화합물의 일종인 paraoxon에 의해 저해되면서 생성물의 양이 급격히 감소하게 되고, 이때  pH의 변화를 측정한다. pH의 변화는 산-염기지시약의 흡광도변화로 측정할 수 있으며, 산-염기지시약의 흡광도는 633nm He-Ne레이저에서 유도된 광으로부터 측정되어진다. 레이저 광은 2개의 광섬유에 의해서 반응기로 연결되며, 기준탐침 및 지시탐침에서 측정된 AChE의 반응물과 생성물의 흡광도는  포토트랜지스터를 이용하여 전기신호로 변환하였다. 모든 실험은 표준 온도 (20 - 25℃) 에서 실행되었다.

결과 및 토론

본 실험에서는 AChE의 반응을 억제하는 유기인 화합물을 측정하기 위한 광 바이오센서에 사용되는 AChE 고정화 LB막형성의 최적조건을 연구하였으며, 형성된 막의 표면을 AFM으로 분석하였다.

AChE의 viologen 단분자막으로의 흡착을 측정하기 위하여 □-A isotherm이 이용된다. 수면에서의 순수한 단분자막과 AChE가 흡착된 단분자막에 대한 □-A isotherm은 그림 2와 같다. 그림에서 AChE가 흡착된 단분자막에서 상의 변화가 명확하지 않았으며 압력이 0 일때의 분자당 면적이 순수한 단분자막에서 보다 증가함을 볼 수 있었다. 이것은 AChE가 단분자막의 친수기에 전기적인 힘에 의해 흡착되면서 분자당 면적을 증가시킴을 나타낸다.

AChE를 viologen 단분자막에 흡착시키는 동안 물 속에 있는 AChE의 양에 따라 단분자막에 흡착되는 AChE의 양도 변화한다. 이것은 AChE가 단분자막의 친수기에 흡착이 진행되면서 수면상으로 단분자막의 친수기를 상승시키면서 발생하는 효과라 할 수 있다. 그림 3에서는 1시간 동안 변화된 단분자막의 표면압변화량을 표시하였다. AChE의 양이 증가함에 따라 표면압의 변화량은 300unit까지 계속 증가함을 볼 수 있다. 반면에 300 ~ 500unit사이에서의 변화량은 극히 미약하였으며, 따라서 AChE 흡착을 위한 최적의 AChE양을 300unit으로 정하였다.

AChE가 흡착된 단분자막을 기판 위에 누적할때의 누적층수 최적조건을 구하기 위하여 그림 4에서는 누적된 층수에 따른 신호의 변화를 보았다. AChE가 흡착된 단분자막의 표면압을 37mN/m으로 압축하여 단분자막의 고체상을 형성한 후 기판위에 누적할때 층수를 증가시킴에 따라서 신호가 증가함을 볼 수 있었다. 그림에서 누적 층수 60 과 70사이에서는 신호의 변화가 크지 않음을 볼 수 있었다. 본 실험에서 최적의 누적 층을 형성하기 위해서 60층으로 구성하였다.

그림 5는 AChE가 단분자막에 의해 기판 위에 누적된 후 기판의 표면에서의 모양을 AFM을 이용하여 측정한 그림이다. 그림에서 흰 부분이 viologen 단분자막 위에 고정화된 AChE이다. AChE가 효과적으로 viologen 단분자막에 흡착되어있음을 볼 수 있다. AFM에 의한 분석을 수행하기 위하여 AChE-LB막이 누적된 기판제작시 AChE가 표면에 위치하도록 제작하였다.

제작된 다층 AChE 막을 이용한 유기인 화합물의 농도 변화에 따른 신호는 그림6과 같다. 검측 시간이 5분 일때 유기인 화합물의 농도 변화에 대한 검측된 신호가 비례함을 알 수 있었다. 유기인 화합물의 농도 0 ~ 2.0 ppm에서의 신호는 직선적인 증가를 보였다. 이것은 우리나라에서는 1급수인 겨우 0.2ppm이하, 2급수인 경우 1ppm이하로 제한하고 있으므로 직선적인 측정신호의 증가는 이에 부합된다.

REFERENCES

[1] Alfthan K., Kenttamaa H. and Zukale T.: Analytica Chimica Acta, 217,      43(1989)

[2] Dumschat C., Muller H., Stein K.  and Schwedt G.: Analytica Chimica Acta,  252, 7(1991)

[3] 최정우, 민준홍, 이원홍: 센서학회지, 제3권 제2호, 50(1994)

[4] Skladal, P.: Analytica Chimica Acta, 252, 11(1991)

[5] Kajiyama T., Oishi Y., Hirose F., Shuto K. and Kuri T.: Chemistry Letters, 1121(1993)

Fig5. AFM image of AChE onto the viologen monolayer