생체기능성 고분자를 이용한 Testosterone의 선택적 인식 및 분리

정 수환, 박 중곤, A. Rachkov*, I. Karube*

경북대학교 공과대학 화학공학과, *동경대학 RCAST biosensor 연구실

Specific Recognition and Separation of Testosterone using biofunctional polymer

S.H, Cheong, J.K. Park, A. Rachkov*, I. Karube*

Department of Chemical Engineering, Kyungpook National University, Taegu

*Research center for Advanced Science and Technology, The University of Tokyo, biosensor Lab.

서 론

최근 Molecular imprinting(MIP)은 아주 단단하게 가교 결합된 polymer matrix내에 template 분자를 기억시킬수 있는 자리를 만드는 수단으로서 많은 관심을 받고 있다[1-3]. 이 MIP를 만드는 일반적인 방법은 우선 crosslinker가 많은 비율로 들어있는 용액에 녹아있는 tempalte 분자 주위에 중합할수 있는 functional monomer를 결합시킨다. 그다음 이 혼합물을 고분자화(polymerization) 하고 마지막으로 imprinting polymer를 형성시키기 위해서 template를 제거시킨다. 이렇게 만들어진 imprinting polymer는 template 에 대한 모양과 화학적 기능이 상보적으로 이루어진 3차원 구조의 미세공극을 가진 다공성 matrix가 된다.  중합할 때 가교 결합의 정도가 template 를 제거한 후에도 그들의 모양을 유지할 수 있도록 하여주며, functional group은 본래의 물질을 재인식할 수 있도록 배열되는 기능을 가지고 있다. 이 MIP 방법의 이점은 polymer합성이 간단하며 물리적 화학적 안정성이 높고 비용이 싸게들어 넓은 온도 범위에서 사용이 가능하다는 것이다.

Imprinting 기술은 크게 두가지로 나눌어 볼 수가있다. 첫째는 template와 functional monomer 사이에 covalent 결합을 형성하는 것으로, 이것은 중합(polymerization)에 따른 공간적 배열이 고정화 되는 것이다. 이에 대한 대표적인 예로서는 4-vinylphenyl boronic acid esters를 사용한 sugar 유도체의 imprinting 이다[1]. 두 번째는 일련의 noncovalent interation (hydrogen bonding, elctrostatic interation) 으로서 template 주위에 functional monomer가 자동적으로 배열 형성 되는 것이다. 이에대한 최근의 연구서는 Mosbach group에서 주로 많이 이루어지고 있으며 이 예로서는 amino acid, peptides, nucleotides 그리고 xathies 와 diazepam의 유도체에 대한 imprinting 등이 있다[4-6].

이와같이 molecular imprinting은 chromatograhpy, catalysis, receptor function 그리고 sensor 개발 등 넓은 범위에서 사용될 수가 있다. 그런데 지금까지 생물학적이나 임상학적으로 중요함에도 불구하고 steroid가 imprinting의 물질로서 사용되어온 예가 그렇게 많지 않다[7-8]. Steroid는 크고, 구조적으로 유사한 유기 분자로 이루어져 있으며 단단하고 입체화학적으로 복잡한 hydrocarbon 구조로 되어있다. 특히 스포츠 분야에서 불법적인 신진대사 steroid의 사용이 급격히 증가함에 따라 빠르고 정확하고 값싼 수단에 의해서 이들 약품이나 대사물질을 측정할 필요성을 느끼게 되었다.

따라서 본 연구에서는 기존의 특이성이나 민감성을 유지하면서도 간단하고 값싼 장치로 Sensor를 개발하기위한 기초적인 작업으로서 특정 Steroid, 즉 testosterone를 선택적으로 인식할수 있는 molecular imprinting polymer를 만들고자한다. 이를 위해서 functional monomer, solvents, template/monomer ratio 그리고 개시온도 등 여러 가지 조건에 대해서 조사되어졌다.

재료 및 방법

1.고분자의 준비 및 시약

고분자들은 다음 시약을 사용하여 준비하였다. template monomer로서는 testosterone 을 사용하였고 functional monomer 와 crosslinker는 Methacrylic acid(MAA), Ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA) 가 각각 사용되었다. 중합은 7.5 ml의 용매 속에 1mmol의 template 와 8mmol의 functional monomer를 완전히 섞은 다음 5ml의 crosslinking agent와 50mg의 initiator(ABDV)를 첨가하였다. 이 혼합물을 50ml 유리병에 옮긴후 약 10분 동안 질소를 불어 넣고 열 중합의 경우에는 40oC 와 60oC 의 oven 에서 약 16시간 동안 수행하였다. 광 중합은 UV(365nm)을 사용하여 room tem.에서 동일한 시간동안 수행하였다. 기준 고분자(reference polymer)는 template 로 사용된 testosterone만 넣지않고 다른 것은 모두 동일한 조건에서 만들어졌다. 만들어진 고분자는 25-45□m 크기로 작게 분쇄 한 후 tempalte를 제거하기위해서 60oC에서 24시간 동안 에탄올로 씻어내었다. 이 과정은 testosterone이 washing 용액으로부터 완전히 제거될 때 까지 반복 되었다. 이렇게 준비된 고분자는 HPLC column에  packing 되어 사용되었다.

2.HPLC 측정

고분자를 slurry packing 시켜 준비한 column(100x4.6mm)을 안정한 baseline 이 될 때가지 acetonitrile로 씻어내었다. 샘풀 주입 양은 0.2mmol 농도를 10□l, 측정 파장은 225nm, mobil phase의 속도는 2.0 ml/min 그리고 void marker 로서는 aceton 이 사용되었다. Capacity factor(k')는 (t-to)/to, separation factor(□)는 (t2-t1)/(t1-to)로 각각 계산하였다. 여기서 t, t1, t2는 각 샘풀 성분의 retention time 이고 to는 void marker의 retention time 이다. HPLC 분석은 805 manometric module, 305, 306 HPLC pump 그리고 118 uv/vis detector로 구성된 Gilson(france) system에 의해서 수행되어졌다.

3.Batch binding 연구

Imprinting 과 nonimprinting polymer 30mg 을 각각 Eppendorf tube에 넣고, 농도를 알고있는 testosterone 1ml를 tube에 함께 섞은 다음 room temp.에서 20시간 동안 일정하게 흔들어준다. Imprinting polymer에 대한 free(unbound) testosterone의 농도는 상등액을 분석하므로써 알 수있었고 bound template의 양은 reference 와 free testosterone의 양에 차이에 의해서 계산 할 수 있었다. 이에대한 측정은 UV(238nm)로 수행하였다.

결과 및 고찰

Testosterone을 선택적으로 인식하고 분리할 수 있는 molecular imprinting polymer를 효과적으로 합성하기 위해서 여러 가지 조건에 대하여 살펴보았다. 먼저 고분자 중합 온도에대하여 살펴보았다.(Table 1.)

Table 1. Separation factor(□) data obtained from HPLC analysis of imprinted polymers prepared by different initiation methods

Compound	Heating 40oC 60oC		UV 20oC
Testosterone	1.000	1.000	1.000
□-Estradiol	2.957	1.768	2.000
Progesterone	5.669	3.285	4.005
T-propionate	7.524	4.604	5.142
Estrone	8.504	5.729	5.995

Table 1에서 볼 수있듯이 40oC 에서 가장 좋은 결과를 얻었으며 60oC와 UV(20oC)에서 보다도 평균적으로 1.65배, 1.45배 높게 나타남을 볼 수 있었고 이는 고분자 중합시 낮은 온도범위에서 template와 functional monomer사이의 결합이 잘 이루어져 인식 할 수 있는 자리가 많이 형성됨을 알 수 있었다. Functional monomer(MAA)와 tempalte 비는 8:1 일 때 최적의 선택성을 보였다.        합성된 고분자의 선택적 반응의 정도는 유사한 구조를 가진 다른 Steroid (Estrone, Progesterone, Testosterone-propionate, □-estradiol)를 비교하므로써 알 수가 있었다. 비교방법은 HPLC column에 Imprinting polymer를 이용하여 capacity factor를 측정하므로써 가능하였다. Testosterone에 대한 capacity factor는 4.5 이고 다른 유사한 steroid는 void volume과 가깝게 나타났다(capacity factor ; 0.53-1.52). Testosterone과 다른 steroid 혼합물을 분리할 때 baseline 분리(Fig 1.)가 이루어 짐을 볼 수가 있었다(Resolution ; 0.8-1.3). Imprinting polymer에 대한 Testosterone의 affinity 정도( association constant, binding site)를 양적으로 측정하기 위해서 batch binding 연구도 수행하였다. 측정은 spectrophotometric 과 HPLC 각각에 대해서 수행하였다. binding site의 수는 1.6-2.5 □mol of testosterone/g of polymer이고 association constant에 기초해 계산된 binding strength의 수는 □G=-4kcal 로 나타났다.

이와같이 Molecular Imprinting Method은 분리 및 인공 효소, 그리고 biosensor 등에 많이 이용되고 있다. 따라서 본 연구에서 개발된 선택성이 높은  Imprinting polymer를 이용하면 기존의 specificity 와 sensitivity를 유지하면서도 더 안정하고 간단한 장치로 sensor를 만들 수 있을 것으로 사료된다

참고문헌

1. Wulff G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, 1812-1832(1995).

2. Mosbach K. Trends Biochem. Sci., 19, 9-14(1994).

3. Shea, K. J. Trends Polym. Sci., 2, 166(1994).

4. Vlatakis, G., Andersson, L. I., Muller, R., and Mosbach K. Nature, 361, 645-647(1993).

5. Shea, K. J., Spivak, D. A., and Sellergren, B., J. Am. Chem. Soc., 115, 3368-3369(1993).

6. Matsui, J., Kato, T., Takeuchi, T., Suzuki, M., Yokoyama, K., Tamiya, E., and Karube, I., Anal. Chem., 65, 2223-2224(1993).

7. Whitcombe, M. J., Rodrigues, M. E., Villar, P. and Vulfson, E. N. J. Am. Chem. Soc., 117, 7105-7111(1995).

8. Bystrom, S. E., Borje, A., Akermark, B., J. Am. Chem. Soc., 115, 2081(1993).