인공간 제작을 위한 간세포 spheroid 배양법 개발

류 재 남, 박 정 극

동국대학교 화학공학과

Development of spheroid culture of liver cell

for artificial liver support system

Jae-Nam Ryu, Jung-Keug Park

Dept. of Chem. Eng., Dongguk University

서론

동물세포 배양기술의 한 분야로서 최근에는 monolayer culture로부터 시작하여 in vitro에서 실제 생체내의 기능을 갖도록 세포분화를 유도하여 다양한 조직을 구성하는 조직배양공학(Tissue Engineering)이 광범위한 응용성을 가지고 연구되고 있다. 이는 생성된 조직자체를 product로 이용하는 기술로서 세포-세포 또는 세포-조직사이의 상호작용등에 관하여 생체내 특성을 그대로 가진 조직으로 분화시키기 위하여 3차원적으로 배양한다. 이러한 조직배양기술은 사람의 분화된 세포를 분리, 배양한 후 본래의 조직형태로 in vitro 에서 재구성한 뒤 이를 인공장기(피부, 혈관, 심장, 신장, 간장, 망막 등) 개발에 이용할 수 있다(1-3).

본 연구의 목적은 인공간 제작을 위하여 간세포의 일차배양방법 확립 및 최적화와, 간세포의 Spheroid culture 기술개발 및 배양조건의 최적화, 그리고 체외배양한 monolayer 간세포 및 spheroid에 대한 간기능 assay를 통하여 간기능 활성도를 확인하는 것이다.

실험방법 및 재료

간 세포의 분리는 Seglen-method(4)에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하는데, 이는 in situ 상태에서 2단계로 시행하는 collagenase perfusion 테크닉으로서 그 방법은 다음과 같다. 180-200g 정도 무게를 갖는 rat을 케타민(0.1 ml/rat 100g)과 럼푼(0.01ml/rat 100g)을 주사하여 마취시키고, 해부용 가위와 메스를 사용하여 쥐의 복부를 열어 1단계로서, 간문맥(potal vein)을 찾아서 catheter를 꽂아 calcium-free HEPES 버퍼를 25 ml/min의 속도로 10-15분 흐르게 하여 충분히 세척한다. 2단계로는 0.05% 농도의 콜라젠 분해 효소를 넣은 동일 완충용액을 20 ml/min의 유속으로 10분 동안 흐르게 하여 간조직의 기질부분을 느슨하게 분해한 후 나일론 매쉬나 거즈에 거르고 약하게 원심분리하여 거의 간세포만을 모은다. Bellco spinner flask에서의 spheroid 배양은 총배지의 체적을 100ml로 하였으며 교반속도는 60∼120rpm을 유지하였다. Spheroid의 viability는 trypan blue 염색법을 사용하여 비교하였으며, 암모니아는 아산제약의 kit를 Urea의 농도는 Sigma kit를 사용하여 측정하였다.

결과

간세포의 분리는 Seglen-method(4)에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하는데, 이는 in situ 상태에서 2단계로 시행하는 collagenase perfusion 테크닉을 이용하는 방법이다. 분리된 간세포의 세포수와 생존도를 향상시키기위해서는 관류시키는 버퍼는 37℃의 온도로 유지시키고 버퍼용액은 실리콘튜브를 통과시키면서 90% O2/10% CO2 의 혼합가스로 평형시켜야 하며,  콜라젠 분해 효소(0.05%)는 pH 7.3-7.5로 조정하여준다. 원심분리 조건은 4℃, 500 RPM에서 2분간 원심분리하여 간세포를 회수한다. 이와 같은 조건과 함께 20ml/min의 유속으로 콜라젠 분해 효소 관류시간에 따른 간세포의 세포수와 생존도는 효소관류 10분후가 총세포수와 생존도가 가장높은데, 총세포수는 2 □ 108에 생존도는 약 80%에 이른다. 콜라젠 분해 효소 관류 시간에 따른 간의 digestion 정도는 100□m의 나이론 메쉬의 여과 후 간세포 모양은 5분, 10분 모두 다소 부정형이고, in situ에서의 세포모양을 나타낸다. 그리고 digestion 정도는 10분간의 콜라젠 분해 효소 관류가 5분보다는 다소 잘 이루어진다.

Spinner flask에 세포를 접종한 후 약 2∼3일이 지나면 간세포의 spheroid가 형성되며 직경은 평균 80∼110□ 내외가 된다. Spheroid의 density는 100□l의 aliquots를 얻어 100□l내의 spheroid의 수를 측정하여 계산하였다. Spheroid의 직경은 배양 7일 후 크게 감소하는데 암모니아가 첨가된 배지를 사용함으로써 spheroid 표면의 세포가 암모니아를 제거하면서 점차 활성을 잃어 교반되어지는 spinner flask의 shear에 의해 표면에서 떨어져 나감으로 직경이 감소되는 것으로 사료된다. 그리고, spheroid 수가 배양기간이 늘어가면서 점차 감소하는데 배지교환시 부유하고 있는 spheroid나 사멸된 spheroid가 배지와 함께 쉽게 빨려 나오기 때문이라고 생각된다.

Spinner flask의 교반속도에 따른 spheroid 형성은 60, 120rpm에서 모두 잘 이루어지고 있고, spheroid의 직경은 60rpm에서 90-110□로 120rpm의 50-80□보다는 2배 크지만 spheroid의 수에서는 120rpm에서 60rpm보다는 2배 더 많은 수를 가지고 있다.

1mM 정도의 암모니아를 배지에 첨가하여 배양된 spheroid의 신진대사 활동을 암모니아 제거와 요소합성으로 분석하였는데, 암모니아가 첨가된 배지는 교반속도 60rpm에서 spheroid가 형성된 후 배양 3일째의 spheroid에 사용하였다. 암모니아는 24시간 후에 거의 완전히 분해되었음을 알 수 있었다. 암모니아 첨가 배지로 교환해준 2일째의 배양배지에서 암모니아 농도는 빠르게 감소하나, 3, 4일째에서는 암모니아 농도 제거율이 서서히 적어지고 있고, 우레아 합성율도 배양시간이 늘어나면서 점차 감소한다.

교반속도 60rpm에서 만들어진 spheroid표면을 SEM으로 찍어본 결과 in vivo 에서와 같은 규칙적인 세포배열 구조가 보였으며, 수많은 미세융모도 보인다. 또한 bile duct나 혈관의 구조와 같은 macropore duct가 나타났고 이 동관을 통하여 영양분과 배설물이 출입하면서 활성도를 유지하는 것으로 사료된다.

참고문헌

1.  Stephan M. Edgiton, "3-D Biotech.: Tissue Engineering", Bio/Technology,

Vol. 10 : 855, 1992.

2.  Robert Langer and Joseph P. Vacanti, "Tissue Engineering", SCIENCE,

Vol. 260: 920, 1993.

3. J.V. Brunt, "Artificial Organs from culture", Bio/Technology, Vol. 9:            136,1991

4.  Seglen P.O.,"Preparation of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell.              Biol., Vol. 13, 29-83, 1975

Time-course changes in ammonia removal in the spheroid culture.