미생물이 생산하는 계면활성제의 발효 최적화 및 분리 공정의 개발

안도균·박 창호·양지원*·이상엽*

경희대학교 화학공학과, 한국과학기술원 화학공학과*

Optimization of the Biosurfactant Fermentation

and Separation Processes

Doh Gyeuhn Ahn, Chang-Ho Park, Ji-Won Yang* and Sang Yup Lee*

Dept. of Chemical Eng., Kyung Hee University, Yongin-Si 449-701, Korea

*Dept. of Chemical Eng. Korea Advanced Institute of Science

and Technology, Taejon 305-701, Korea

서론

기상, 액상, 고상 중에서 2상간의 경계를 계면이라고 하며 이러한 계면에서 각 상의 표면에너지를 감소시켜서 습윤, 유화, 분산, 발포, 가용화, 세정, 윤활 등의 작용을 하는 것이 계면활성제이다. 미생물을 이용하여 계면활성제를 생산하는 원리는, 포도당이 결핍된 상태에서 미생물이 물에 불용성인 기름을 탄소원으로 체내로 흡수하기 위하여 체외로 기름을 유화 시킬 수 있는 물질인 계면활성제를 내는 성질을 이용하게 된다. 하지만 기름을 탄소원으로 사용하는 미생물중에서 포도당을 탄소원으로 사용하여 계면활성제를 생산한 예가 보고되었으며 본 실험의 미생물도 이러한 종류에 속한다. 생물계면활성제가 생분해성, 무독성, 생체적합성 등의 화학합성계면활성제에 비하여 장점을 가지고 있으면서도 그 상업적 이용이 부진해온 것은 생산비용이 너무 높기 때문이다.

미생물에 의한 계면활성제 생산에 영향을 미치는 주요인자로는 탄소원의 종류, 영양원의 제한, 탄소원과 질소원의 비의 변화 및 질소원의 종류, pH, 용존산소의 양, 온도, 교반속도, 다가이온의 공급, 성장시기, 생산물에 의한 저해작용등이 있으며 또한 생물계면활성제의 성능을 알기위하여 표면장력의 감소능이나 유화능을 시험하여 간접적으로 그 생산량을 알수가 있다.

본 실험에서는 기름을 사용하여 유화제를 생산하는 균주 중에서 포도당 또한 탄소원으로 하여 유화제를 생산하는 미생물중 하나를 선별하여 Pseudomonas aeruginosa YPJ-80이라 명명하였고 생성된 유화제는 rhamnolipid 계통임이 확인되었다. 이 균주에 의한 유화제 생산의 초기 pH의 최적치를 flask 배양을 통하여 1차적으로 정하고 7L 발효조를 이용하여 온도, 공기공급량 및 pH에 의한 효과를 연구하였으며 또한 기존의 분리 방법중 최적의 분리방법을 모색하였다.

실험

유화제 생산을 위한 기초 배지조성은 (A) Glucose ; 20g/l, MgSO4·7H2O ; 0.5g/l, (B) NH4NO3 ; 1.0g/l, K2HPO4 ; 1.0g/l, KH2PO4 ; 0.5g/l, Yeast extract ; 1.0g/l, (C) NaCl ; 0.1g/l, CaCl2·2H2O ; 0.01g/l, MnSO4·5H2O ; 0.01g/l, FeSO4·7H2O ; 0.01g/l 으로 A, B, C로 나누어 멸균 후 상온에서 혼합하였으며 Sigma 시약을 사용하였고 pH는 1N NaOH 와 1N HCl로 조절하였다. 표면장력은 윤환법을 이용한 일본 吉田사의 표면장력기를 사용하였다. UV-spectrophotometer 는 일본 Shimadzu사 모델 UV-1601을 사용하였으며 발효 실험은 7L 발효조(한국발효기)를 가지고 2L 조업부피로 하여  최초 30℃, 300rpm, 0.18vvm의 공기공급량으로 약 54시간 배양하였고 계속해서 온도, rpm, 및 공기공급량을 달리하면서 배지의 optical density, 유화능, pH, 건조균체량, 표면장력 등을 측정하며 실험하였다.

배양방법

250ml Erlenmeyer flask에 액체배지를 50ml 분주하여 약 10시간 동안 배양한 후 660nm에서 optical density 1.0을 기준으로 2% 접종하였다.

유화능의 측정

Zuckerberg 의 방법을 인용하여 배양액을 20mM citrate-phosphate buffer(pH 5.1)로 60배 희석하여 9.9ml을 채취한 후 여기에 2-methylnaphthalene 과 n-hexadecane 의 동량혼합물(v/v) 0.1ml을 첨가하여 25℃, 150rpm 에서 1시간 동안 왕복진탕하고 10분간 정치한 후에 UV 620nm 에서 흡광도를 측정하여 유화능을 결정하였다.

표면장력의 측정

Du Nouy 의 윤환법을 이용하였으며 이때 온도나 먼지, 표면의 상태등에 따라 표면장력이 변할 수 있으므로 세심한 주의가 필요하였다.

건조균체량의 측정

배양액을 15000×g 로 15분간 원심분리하여 증류수로 두번 세척 후 drying oven 에서 24시간 건조후 평량하여 건조 균체량으로 하였다.

결과 및 토론

Flask 배양에서 30℃, 초기 pH를 7, 8, 9로하여 실험한 결과 유화능의 최대치가 각각 0.121, 0.309, 0.308로 초기 pH가 8일 때의 유화능이 다른 것에 비하여 좋았으며, fermentor 실험에서도 35℃, 초기 pH 7, 8, 9로 실험하여 각각 0.083, 0.907, 0.729로 역시 초기 pH 8로 실험했을 때 유화능이 좋았다. 또한 온도에 대해서는 25, 30, 35℃로 실험하였는 데, 35℃ 에서 가장 높은 유화능을 나타내었다. 증류수의 표면장력은 온도에 따라 차이가 있으나 대략 72∼75dyne/cm을 나타내며  미생물이 계면활성제를 생산함에 따라 표면장력이 감소하였는데 최저 29∼30 dyne/cm 까지 감소하였다. pH 또한 생장과 유화제의 생산이 증가함에 따라 반비례하여 감소하였다. 표면장력의 감소로 유화제의 생산을 간접적으로 알 수 있으나 시간이 지남에 따라 표면장력과 유화제 생산량과는 관계가 적은 것으로 생각된다. 발효조 실험에서는 주로 aeration에 의하여 거품이 많이 생겼으며 거품과 더불어 미생물이 발효조 밖으로 다량 빠져나왔으며, 빠져나온 배지의 optical density 및 유화능은 높은 반면에 상대적으로 발효조내의 배지의 optical density 및 유화능은 그다지 더 이상 높아지지 않았다. 이것은 유화제 생산이 다른 요소들 보다도 aeration의 양에 상당한 영향을 받는 것으로 사료된다. 따라서 이러한 배지유출의 문제를 고려하여 미생물을 고정화 시키는 방법을 고려할 필요가 있다. 미생물이 생산하는 유화제를 분리하는 방법으로는 침전법과 추출법을 사용하였으며, 실험한 방법 중에서 유화제를 pH 2.0으로 낮추어서  chloroform/methanol 을 2:1(v/v) 로 섞어서 추출했을 때 가장 효과적인 것으로 나타났다. (Table 1)

Table 1. Separation experiment (condition : 35℃, 600rpm)

Sample and separation method		Emulsifying activity (□=620nm, 60fold dilu.)
Cultured sample		0.430
Supernatant		0.869
Precipitation method	Ethanol	0.329
	Acetone	0.739
Acidification		0.555
Extraction method	Ethylacetate	0.150
	Chloroform/methanol (2:1 vol%)	0.955
	Acidification 한 후 Chloroform/methanol (2:1 vol%)	0.997
Commercial emulsifier	Antifoam A	0.389
	Tween 80	0.378

참고문헌

1. Kosaric, N., W. L. Cairns and N. C. C. Gray (1987) Biosurfactants and             Biotechnology, Marcel Dekker, INC. : 89-116

2. Kosaric, N. (1993) Biosurfactants, Marcel Dekker, INC. : 18-21

3. J. D. Desai (1987) J. of Scientific ＊ Industrial Reasearch 46, 440-449

4. Rosenberg, E., A. Zuckerberg, C. Rubinovitz and D. L. Gutnick (1979)              Appl. Environ. Microbiol. 37, 402-408

5. Mulligan, C. N., G. Mahmourides and B. F. Gibbs (1989) J. of                    Biotechnology 12, 199-210