유가식 발효기에서 sucrose를 기질로 사용하는 E.coli W의 고농도 배양

이 정석, 이 상엽, 박선원

한국과학기술원 화학공학과

High cell density culture of E.coli W in the fed-batch culture using sucrose as a carbon source

Jeongseok Lee, Sang Yup Lee, and Sunwon Park

Department of Chemical Engineering, KAIST, Taejon 305-701, Korea

서론

Escherichia coli W는 Gleiser 등[1]이 보인 바와 같이 수크로즈(sucrose)를 탄소원으로 사용한다. 이들은 이 균체를 수크로즈와 yeast extract로 이루어진 배지에서 산소소비량에 따른 기질농도 제어 방법으로 유가 발효하여 42 g/L의 농도까지 배양하였다. 그리고, 최근에 Lee 등[2]이 같은 균주를 수크로즈가 포함된 제한배지에서 pH-stat 유가방법을 통해 36시간(기질공급 30시간)동안 105 g/L까지 배양하였다. 수크로즈는 보통의 E.coli류들이 기질로 이용하는 글루코즈(glucose)보다 상당히 낮은 가격이므로 고농도 배양시에 훨씬 경제적이나, 이 균주에 대한 연구는 아직 미흡한 편이다. 본 연구에서는, 고농도 배양(High cell density culture, [3, 4])방법을 이용하여 수크로즈를 기질로 사용하는 Escherichia coli W를 제한배지 내에서 배양하였는데, 이때 공급되는 수크로즈의 적정 공급 속도는 모델과 배지 분석자료를 실시간으로 이용함으로써 결정하였다.

이론

유가식 배양에서 균체의 성장은 발효기로 공급되는 제한기질의 양에 의해 좌우되며, 비구조 모델[5]에 따르면 균체는 비성장속도 □가 어떤 값 □s로 일정하게 유지될 경우 시간에 대해 다음과 같은 지수적인 곡선을 그리며 성장한다.

[eqn: X(t)=X(0) exp(mu_s t)]

()

그리고, □가 기질 농도만의 함수로 표현되고 단위 기질당 균체 수율인 YX/S가 발효기간 동안 일정하다고 가정할 때 기질의 공급속도는 모델로부터 다음과 같이 유도할 수 있다.

[eqn: F(t)={mu_s X(0)}over{(s_F -s) Y_{X/S}}exp(mu_s t)]

()

그러나, 이식에는 단지 발효 초기조건과 가정한 상수들만이 포함되어 있을 뿐 실시간으로 측정한 데이터는 쓰이지 않고 있다. 만약 발효 중에 균체의 농도 또는 비성장속도 등을 측정할 수 있다면 이식을 보정하여 발효조건의 변화에 맞추어서 기질의 공급량을 적절히 조절해 줄 수 있을 것이다. 시간 ta와 tb에서 측정한 데이터를 고려할 때 이식은 다음과 같이 다시 쓸 수 있다.

[eqn: F(k)={mu(t_b )X(t_a )}over{s_F Y_{X/S}} left[ 1+ mu(t_b ) k Delta t right]]

()

이때 □(tb)는 □의 측정값으로부터 구한다.

[eqn: mu(t_b )=mu_s + K_{c, mu} left(mu_s - mu(t_a ) right)]

()

재료 및 방법

본 실험에서 사용한 균주는 Escherichia coli W(ATCC 9637)로 R-medium (Lee and Chang, 1993, modified from Riesenberg et al., 1991)에서 배양한다. 균주는 New Bronswick사의 3.5 L 발효기에서 유가식으로 배양하며, 용존산소농도(DO)와 pH는 Ingold사의 전극을 각각 이용하여 측정하였다. 최초 배지는 1.5 L로, 100 mL의 seed culture를 접종하였고, 이때부터 종료시까지 pH와 온도는 각각 6.8과 37℃를 유지하였는데, pH의 제어에는 28% 암모니아수를 사용하였다. DO는 접종 5시간후 공기를 2 vvm으로 공급하면서 교반속도를 조절하여 20% 이상으로 계속 유지하였다. 교반속도가 700-800 rpm에 이르고 거품이 가득찼을 때에 순수 O2를 공급하면서 교반속도는 300 rpm으로 낮추고 이후 다시 교반속도를 조절하여 DO를 30%로 유지하였다. 균체 접종후 6-7시간이 지나고 DO와 pH가 급격히 변하면 그때부터 탄소원을 포함한 공급배지를 도입하였다. 배지의 공급은 발효기에 장착된 peripatetic pump를 이용하였고, AD/DA converter를 통하여 컴퓨터로 제어하였다. 30분에 한번씩 10 mL의 시료를 배지로부터 취하고 600 nm에서 optical density (OD)를 측정하였다.

결과 및 토론

먼저 식(2)를 이용한 기질의 지수 공급 방법을 실험하였다. 여러 비성장속도값(□s)에 대해 실험을 한 결과가 그림 1에 주어져 있다. 이때 DO나 pH등의 변수들은 상기한 적절한 값으로 유지하여 기질 도입속도 F만이 성장에 제한적인 요인으로 작용하도록 하였다.

그러나, 위의 방법을 이용한 몇몇 실험에서는 실제 성장 곡선이 예상했던 지수형 곡선과 달라서 결국에는 고농도에 이르지 못하였다. 그 이유는 공급 배지가 원하는 비성장속도로 균체가 성장하기 위해 필요한 양보다 과다하게 또는 부족하게 공급되었기 때문이며, 이것은 앞에서 F를 유도하기 위해 참조한 비구조 모델의 부정확함에 기인한 것으로 보인다. 과다 공급된 기질은 일시적으로 비성장속도를 증가시키나 비성장속도는 최대값을 가지는 것으로 알려져 있으며, 이 값에 이르거나 혹은 시간이 갈수록 배지 내에 잉여 기질이 축적되어 균체의 성장을 방해하게 된다. 반면 기질의 공급이 부족하면 기질이 배지 내에서 고갈되어 비성장속도가 점점 감소한다. 따라서, 이 두 가지 경우에 대처하기 위해서 실시간으로 균체의 성장 상태를 관찰할 필요가 있다.

이렇게 기질을 필요량보다 과다하게 혹은 부족하게 공급하는 것을 막기 위하여 배지의 일부를 실시간으로 취하여 현재 균체의 성장속도를 알아내고 이를 기질 공급 속도식에 반영하였다. 이때는 OD와 같이 간단하고 빠르게 균체 농도를 측정할 수 있는 방법을 사용하였다. 그림 2는 그 결과로서, 두번의 실험에서 각각 104 gDCW/L와 110 gDCW/L의 최종 균체 농도를 얻었다. 배지의 일부를 30분마다 취하여 OD를 측정하고 이 30분 동안 □가 거의 일정하다는 가정 하에서 현재의 비성장속도 □를 이로부터 식(1)을 통해 추정하였다.

그리고, 이 방법에 따라 기질 공급속도 F를 조절하여 □의 증감에 대처하였다. 배지내 초기 기질은 회분발효구간이 끝나면 고갈되므로, F의 양에 따라 □의 증감이 일어날 때 positive feedback의 개념으로 제어를 하였다.

비교적 부정확하다고 할 수 있는 분석방법인 OD 측정법을 이용하여서도 상당히 높은 농도까지 E.coli W를 배양할 수 있었다. 이 방법의 단점은 시료를 더 자주 취할 수는 없다는 것이다. 좀더 자주 시료를 분석할 수 있다면 그림 2(a)에서와 같이 고농도 구간에서 실제 균체 농도 X의 시간에 대한 궤적이 일정한 □가 유지될 때의 궤적보다 처지는 현상을 막을 수 있을 것이다.

결론

본 연구에서는 수크로즈를 탄소원으로 사용하는 Escherichia coli W를 유가식으로 고농도까지 배양하였다. 균체가 지수 성장하도록 기질 공급속도를 되먹임 제어 방법으로 조절하였다. 먼저 실시간 측정치 없이 기질을 지수함수적으로 공급하는 경우와 되먹임 제어를 적용한 경우를 실험하여 비교하여 실시간 되먹임 제어의 가능성을 알아보았다. 그리고, 시료의 OD를 측정하여 현재의 비성장속도값을 근사적으로 추정하고 이 비성장속도를 제어하기 위해 기질 공급속도를 적절히 조절하였다. 이러한 실험들을 통하여 3.5 L의 발효기에서 104 g/L와 110 g/L의 최종 균체 농도를 얻을 수 있었다.

감사의 말

본 연구는 포항공과대학의 자동화 연구 센터와 한국 과학재단으로부터 부분적인 재정지원을 받아 이루어졌으므로 이에 감사드립니다.

(a)	(b)

그림 1. 기질의 지수공급 결과; X[g/L] vs. times[hr], (a)□=0.1 hr-1, (b)□=0.15 hr-1

(a)

(b)

그림 2. 되먹임 제어에 의한 발효 결과; 성장 곡선과 배지 공급속도, (a)□=0.2 hr-1, (b)□=0.15 hr-1

참고문헌

1. Gleiser, I. E. and S. Bauer, Biotech. and Bioeng., vol. 23, pp. 1015-1021, 1981.

2. Lee, S. Y. and H. N. Chang, Biotech. Letters, vol. 15, no. 9, pp. 971-974, 1993.

3. Kleman, G. L. and W. R. Strohl, Curr. Opin. Biotech., vol. 5, pp. 180-186, 1994.

4. Riesenberg, D., Curr. Opin. Biotech., vol. 2, pp. 380-384, 1991.

5. Lee, S. C., ph. D. thesis, 1993.