D-(□)-hydroxyisobutyric acid 생산의 최적 조건에 관한 연구 및

다른 지방족산에 대한 적용

김 준,* 정 재철,* 이 왕식,** 정 구헌,** 이 선복*

포항공과대학교 화학공학과*

(주) 종근당**

A Study on the optimal conditions for

the production of D-(□)-hydroxyisobutyric acid and

adaptation to other carboxylic acids

Joon Kim, Jae Cheol Jeong, Wang Sik Lee, Gu Heon Jeong and Sun Bok Lee

Department of Chemical Engineering,

Pohang University of Science and Technology*

Jong Kun Dang**

서  론

Captopril은 가장 효과적인 고혈압치료제이며 그 구조에 두 개의 키랄센터를 가지고 있다. 그러나 이러한 두 이성질체중에서 오직 한가지만이 체내에서 약으로써 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

HIBA는 captopril을 생산하는데 중간물질로 사용되며 역시 두가지 이성질체를 가지고 있다. 이중 D-form만이 체내에서 유용한 것으로 알려져 있다. 화학적 방법으로 HIBA를 생산할 경우에는 D,L-form이 혼합된 형태로 제조되기 때문에 분리하는 방법도 어려우며 최종 생산물까지 도달하는 데 수율이 상당히 떨어지게 된다. D-form의 HIBA만을 생산하는 데 있어서 현재까지 생물학적 전환에 의한 생산이 가장 유용한 것으로 보고되었으며1 기질로는 isobutyric acid나 methacrylic acid를 사용하여 생산한다. 사용되는 균주로는 Candida rugosa 종이 생산성이 가장 높은 것으로 보고되었으며 변이주를 이용한 실험도 수행되었다. 모균주 및 변이주로 HIBA를 생산할 경우 광학순수도는 99%를 넘는다.

HIBA 뿐만 아니라 다른 hydroxycarboxylic acid들도 의약분야에서 중요한 중간물질로 사용된다.2 본 연구에서는 이 균주를 바탕으로 HIBA 생산에 있어서의 최적 조건을 구하고 이 조건을 이용하여 다양한 carboxylic acid들의 생전환에 관한 실험을 수행하였다.

실  험

HIBA 생산 균주인 Candida rugosa는 IFO(Instisute for Fermentation, Osaka, Japan)에서 분양받아 사용하였다. 균주의 보관은 YM 배지에서 30OC로 하루 배양한 후 냉장고에서 보관하였고 매월 계대배양하여 사용하였다. 성장배지나 생산배지는 보고된 바대로 사용하였고3,4 반응기 내의 IBA농도는 최적생산농도인 2%를 유지하도록 하였다. Cell들의 에너지원으로 사용되는 glucose 공급용액은 333g/L의 농도를 만들어 사용하였고 반응기내의 pH를 제어하기 위한 용액은 NaOH, IBA, 증류수의 비를 1 : 4.75 : 2.5(무게비)로 맞춘 것을 사용하였으며 이 용액으로 반응기내의 부족한 IBA의 양 및 pH를 일정하게 조절할 수 있도록 하였다.

반응은 baffle 달린 1L 플라스크에 100mL씩 2개를 30OC, 150rpm으로 shaking incubator에서 24시간 배양하여 반응기에 접종하였다(3L working volume in 5L jar fermentor, Korea Fermentor Co., Korea). 반응도중 반응기내의 pH는 7.5로 맞추었으며 통기량은 1~2vvm, 교반속도는 600~800rpm을 유지하였다.

Cell들의 더 이상의 성장없이 에너지원만을 공급하기 위하여 glucose용액만을 사용하였다. 이때 최적의 glucose양을 결정하기 위하여 초기 반응기내의 glucose와 유가식으로 공급하여주는 glucose의 양을 정하기 위하여 각각의 농도에 따른 실험을 수행하였다.

반응중의 cell growth는 spectrophotometer를 이용하여 600nm에서의 optical density를 측정하여 건조균체중량으로 환산하여 관찰하였다. Glucose의 농도는 발색법(SIGMA, Cat.NO.635)과 이온칼럼(DIONEX)을 동시에 이용하여 측정하였다. 또, broth내의 IBA와 HIBA의 농도는 broth를 원심분리한 후 20배 희석하여 증류수와 황산으로 pH를 2로 맞추어서 HPLC(KNAUER, Germany)로 UV lamp 파장 210nm에서 분석하였다. 이 때 사용한 이동상의 조성은 2%의 메탄올(v/v)을 1L의 증류수에 섞어서 phosphoric acid로 pH를 2.5로 맞추어서 사용하였다.

다음으로는 다른 carboxylic acid들의 □-hydroxylation에 대한 실험을 수행하였다. 다른 실험조건은 위와 동일하며 기질로는 C4~C8까지의 산을 사용하였다.

결과 및 토론

본 연구에서는 HIBA 생산균주인 Candida rugosa IFO0750을 이용하여 HIBA생산에 산업적으로 응용할 수 있는 최적조건을 조사하였다. 최근의 연구결과 보고에 의하면 유가식 배양으로 5일에 100g/L의 HIBA를 얻었는데 그 결과에 의하면 탄소원으로써 glucose 뿐만 아니라 질소원 및 무기염류를 모두 공급함으로써 계속적인 cell의 성장을 유도하여 HIBA를 생산하였고 교반속도도 실제 상업화에 응용하기에는  높게 조업한 것으로 보고되었다.5 본 연구에서는 공급용액의 최적화 및 교반속도등 산업적인 생산에 필수적인 요소들을 실제적으로 사용이 가능한 수준으로 개선하고자 하였다.

먼저 수차례의 실험결과 HIBA가 2차 대사생산물이라는 것을 알 수 있었다. 따라서 cell이 성장과 관계없이 HIBA의 생산을 유도하기 위한 에너지원을 공급하기 위하여 glucose의 농도를 결정하는 실험을 수행하였다. 공급된 glucose는 대사과정중 HIBA를 생산하는데 필요한 cofactor들(ATP, FAD, Coenzyme A)을 생산하는데 이용되게 된다.6 이 실험을 바탕으로 cell이 stationary phase에서 높은 HIBA의 생산량을 유지할 수 있는 glucose의 농도를 결정할 수 있었다. pH의 경우 HIBA를 분해하는 효소인 dehydrogenase의 activity가 없는 7.5부근을 유지하고자 하였다.7 교반속도의 경우 용존산소량을 포화상태의 최저 10%이상을 유지하도록 하였고 800rpm이 넘어설 경우 통기량에 따라 차이가 있지만 broth를 원심분리해 본 경우 cell들이 파손되는 것을 관찰할 수 있었기 때문에(Fig. 1) 800rpm을 넘지 않는 교반속도에서 실험을 수행하였다. 통기량의 경우 2vvm을 넘어서면 foam이 생겨서 반응기내의 내용물이 넘치는 경우가 발생하였다. 따라서 교반속도와 통기량의 적절한 최적화한도에서 반응을 수행하였다.  반응 초기에는 broth의 증발에 의하여 전체 반응물의 양이 줄어드는 경향을 보였으나 glucose와 IBA solution의 공급으로 반응 후 전체 broth의 양은 처음 반응 시작보다 다소 증가함을 알 수 있었다. 일련의 실험을 바탕으로 최소한의 medium 공급과 낮은 교반속도로 cell의 농도를 일정한 수준으로 유지하고 glucose 공급속도 및 IBA의 농도를 일정하게 유지하면서 7일동안의 반응에서 90g/L의 HIBA를 생산할 수 있었다(Fig. 2). 이상에서 얻어진 결과를 바탕으로 실험한 경우 수율은 43%였으며 qp는 0.03이상이었다.

마지막으로 여러 carboxylic acid들에 대한 □-hydroxylation의 실험을 수행하였다. 모균주에 반응성을 보이는 산으로는 valeric acid, methyl-butyric acid등이 있었으며(Table 1), HIBA 생산에서 구한 최적조건으로 모균주에 반응성을 보이는 산에 대한 □-hydroxylation 반응의 생산성을 조사하였다. 다른 carboxylic acid들의 hydroxylation에 대한 생산성을 높이기 위해서는 HIBA 생산으로부터 얻은 최적조건을 개선할 경우 더 높은 생산성을 보일 것으로 예상된다.

감  사

본 연구는 과학 기술처에서 시행한 특정 연구 개발 사업의 일환으로 수행된 것이며 연구비를 지원해 주신 과학 기술처와 종근당에 감사드립니다.

참고 문헌

1.	R.A. Sheldon : Chirotechnology ; industrial synthesis of optically active	compounds, p.58, 1st ed. MARCEL DEKKER, INC (1993)

2.	Hasegawa, J., et al. : J. ferment. Technol., 59, No. 4, 257-262, (1981)

3. Hasegawa, J., Ogura, M,. Hamaguchi, S. : J. Ferment. Technol.., 59, 203-208        (1981)

4. Hasegawa, J., Ogura, M., Kanema, H., Noda, N., Kawaharada, H., and Watanabe,    K., : J. Ferment. Technol., 60, 501-508 (1982)

5.	Lee I. Y., Hong W. K., Hwang Y. B., Kim C. H., Choi E. S., Rhee S., K., and    Park Y. H. : J. Ferment. Bioeng., 81, 79-82 (1996)

6.	Marshall, V. D., Sokatch, J. R. : J. Bacteriol., 110, 1073-1081 (1972)

7. Hasegawa, J. : Agri. Biol. Chem., 45, (12), 2805-2814 (1981)

그림  Effect of agitation speed on cell breakdown

그림  Production of HIBA from IBA by Candida               rugosa IFO 0750

Substrate	Reactivity

Butyric acid	x

Valeric acid	o

methyl-butyric acid	o

Caproic acid	x

Heptanoic acid	x

표 1 Reactivity of other carboxylic acid