제조용 액체 크로마토그래피에서 시료량에 따른 Column의 용량인자와 효율

이 종 호, 최 용 석, 노 경 호

인하대학교, 화학공학과

Capacity Factor and Column Efficiency with Sample Sizes

in Preparative LC

Chong Ho Lee, Yong Seok Choi, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University

서 론

크로마토그래피는 현재 실험실에서 가장 널리 사용되는 분석방법이고 특히 액체 크로마토그래피는 최근에 바이오테크놀로지를 중심으로 하는 의약, 제약, 식품 등의 분야로 공업적 물질생산에 있어서 가장 유효한 분리 정제의 수단으로서 부동의 위치를 차지하고 있다.

액체크로마토그래피를 공학적 분리정제 공정으로 확장시키기 위해서는 연구실 규모의 실험에서 분석을 확인한 후에 제품 생산 능력을 얻기 위한 최적의 정제 설비를 desin하는 것이 과제이며 그 기술 요점이 column의 scale-up이다 [1]. Column내의 상태를 비교적 안정적으로 유지할 수 있는 column packings가 상업화됨에 따라서 column의 조작 조건, 분리 성능에 관한 정량적인 방법으로 해석이 가능해 짐에 따라서 화학공학적 취급에 의한 column의 scale-up 검토가 활발해지고 그 방법이 정착되어 왔다.

역상 액체 크로마토그래피는 혼합 시료의 분리 분석뿐만이 아니라 대상물질의 분리 정제법으로서도 적용되고 있고, 크로마토분리의 목적이나 조건이 다른 조건하에 있어서 폭넓게 이용되고 있다. 이동상의 조성을 조절하여 원하는 분리도에 도달하도록 일정용매조성법 또는 구배용매조성법이 적용되고 있다. 제조용 크로마토그래피에서는 순도와 단위시간당 생산량이 중요하며 주입양이 작은 분석용 크로마토그래피에서는 분리도와 분리시간이 우선한다. 따라서 후자에서는 시료와 고정상간의 관계를 나타내는 용량인자 (capacity factor)와 관의 효율의 이론단수가 기준적으로  사용된다. 주입양, 즉 시료의 양이 증가하면 용량인자와 관의 효율은 변하게 되며 이에 대한 규명은 제조용 크로마토그래피로 scale-up하는데 필수적이다. 본 논문에서는 분석용 규모의 주입양(□g)에서 반제조용(semi-preparative) 규모의 주입양(mg)까지의 변화에 따른 이 두가지 인자의 영향을 고찰하였다.  역상 액체 크로마토그래피에서 사용된 시료는 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-TMP의 뉴클레오타이드이고 이 중에서 5'-GMP는 향미제로서 사용되는 식품첨가제이다[2].

실험

본 실험에 사용한 시료는 5-GMP-Na2(Guanosine 5'-monophosphate Disodium salt), 5-UMP-Na2(Uridine 5'-monophosphate Disodium salt), 5-TMP-Na2(Thymidine 5'-monophosphate Disodium salt)로 Fluka에서 구입하였으며 HPLC-grade의 물에 용해하여 50∼5,000ppm의 혼합용액을 만들어 5∼2,000□를 주입하였다. 이동상은 20mM의 KH2PO4 buffer용액과 organic modifier로 메탄올(97/3 v/v)을 일정용매조성법으로 사용하였고, 유속은 1ml/min로 고정하였다. 물은 실험실에서 제조한 증류수로 감압여과하여 사용하였고 methanol은 Baker Co. (Phillipsburg NJ, USA)에서 구입한 HPLC-grade용매이다.

HPLC는 Waters사의 600E pump(multisolvent delivery system), 486 detector(UV-visible tunable wavelength absorbance), U6K injector (2ml sample loop)를 사용하였고, data acquisition system은 CHROMATE(v.2.1, Interface Eng.)를 PC에 설치하여 사용하였다. Column은 Waters사의 □-Bondapak C18 (3.9×300mm, 10□ particle size)를 사용하였다. UV detector의 파장은 254nm로 고정하였고 모든 실험은 상온에서 행하였다. Dead time은 100□의 methanol을 주입하여 측정하였으며 3.03min이었다.

결과 및 고찰

시료의 양이 column의 효율에 미치는 영향에 대해 Fig. 1에 나타내었다.  5'-GMP를 □-Bondapak C18 column(3.9×300mm, 10□ particle size)에 주입하여 peak의 폭과 체류시간을 측정하였다. 시료의 농도 범위는 33∼1667ppm, 주입부피는 5∼1,000□이고 이는 0.1∼1,667mg에 해당된다. 주입된 시료의 양이 약 1mg 보다 크면 isotherm의 비선형성으로 인해 column의 효율이 급격히 감소하였다[3].  Column의 효율은 baseline에서 측정한 peak의 폭(w)을 이용한 다음 식에 의해서 측정하였다.

[eqn: N = 16 LEFT ( { { t_R} over {w } }RIGHT ) ^{2 }]

시료의 주입부피(x)와 시료의 농도(y)가 용량인자(capacity factor, k')에 미치는 영향을 5'-UMP, 5'-GMP, 5'-TMP의 시료에 대해 선형식의 형태로서 상관하였다.  실험에 의해 구한 용량인자와 상관관계식으로부터 계산한 용량인자를 비교하여 regression coefficient를 구하였다. 이 결과를 Table 1에 나타냈다.  용량인자를 구하는 식은 다음과 같다.

[eqn: k' = LEFT ( { t_R - t_0} over {t_0 } RIGHT )]

tR은 용질의 체류시간이고 t0는 고정상과 상호작용이 없는 물질의 체류시간(dead time)이다.

Table 1에서 보는 바와같이 시료의 주입부피가 클수록 시료의 농도가 작을수록 용량인자가 증가, 즉 column내에서 체류시간이 길어지게 된다.

Table 1. Capacity factors in terms of injection volume and concentration

samples	linear equation	r2
5'-UMP	k'= 0.374+18.895×10-5x-1.269×10-4y	0.87504
5'-GMP	k'= 0.902+8.330×10-5x-2.990×10-4y	0.72667
5'-TMP	k'= 1.988+7.019×10-5x-4.528×10-4y	0.73134

시료량이 증가함에 따라서  peak의 비대칭성을 고찰하기 위해서 peak의 비대칭인자(asymmetric factor, As)를 peak 높이의 10%에서 측정된 값으로 다음과 같이 정의하였다.

[eqn: A_s = LEFT ( { b} over {a } RIGHT )]

a는 peak의 앞쪽에서 peak의 최대치까지의 거리이고, b는 peak의 최대치에서 peak의 끝까지의 거리이다. 즉 As<1은 peak의 fronting이 일어난 경우이고, As>1은 peak의 tailing이 일어난 경우이다. 5'-GMP의 시료량과 비대칭인자(Asymmetry factor, As)의 관계를 Fig. 2에 나타내었다. 일정농도에서 주입 부피가 증가할수록 peak의 tailing이 크게되고 따라서 비대칭인자가 증가하였다. 시료의 농도가 작고 주입량이 증가함에 따라 tailing이 급격히 증가하였다. 일정한 시료량에 대해서 낮은 농도로 많은 양을 주입하는 것이 높은 농도로 적은 양을 주입하는것 보다 peak의 tailing이 심하였다.

크로마토그램에서 peak는 크로마토그램의 높이에 대한 시간의 함수, h(t),로 나타내어 진다.  Peak의 n번째 central moment는 다음과 같이 정의된다.

[eqn: rm mu _n ~=~ { INT _{ 0 }^{INF } (t~-~ mu _1 )^n h(t)dt} over { mu _0 }]

여기서 □0 = peak의 면적, □1 = 평균 체류시간, □2 = peak의 variance이고, peak skewness(S)는 다음과 같이 나타낸다.

[eqn: rm S~=~ { mu _3} over { mu _2 ^3/2 }]

S는 수치적분을 이용해서 구하였다.  Figure 3에서 보는 바와같이 시료량이 증가할수록 낮은농도에서 S가 상대적으로 컸다. 이는 주입된 시료량에 대한 비대칭인자의 경향성과 비슷하였다.  비대칭인자, S는 시료량에 따라 증가한다[4].

단이론에 의해 계산된 용출곡선과 실험값과의 비교를 Fig. 4에 나타냈다. 단이론에 있어서는 시료의 농도에 따라 체류시간의 변화가 없지만 본 실험에서는 시료의 양이 많아짐에 따라 peak가 Gaussian 형태에서 벗어나 체류시간이 변하였다.

참고문헌

1. L.R. Snyder and J.J. Kirkland; Introduction to Modern Liquid

Chromatography, John Wiley & Sons, Inc., New York(1979)

2. 최두찬, 노경호, 정밀화학, 42, 31(1996)

3. N.T. Miller, J. Chromatogr., 550, 301(1991)

4. J.J. Kirkland, W.W. Yau, et al., J.Chromatogr.Sci., 15, 303(1977)

알림

본 연구는 과학재단 핵심전문연구 (과제번호:971-1107-048-2)의 지원에 의한 연구 결과입니다.

Fig. 1. Column efficiency as a function of sample loading

Fig. 2. Effect of sample loading on  As

Fig. 3. Effect of sample loading on  S

Fig. 4. Comparison of the calculated values with the experimental data

(dot : experimental data, sample conc. : 100ppm, injection volume : 600□)