Ornithine-aspartate의 Drown-out 결정화에 관한 연구

신동명(학), 김운수(학), 김우식(정), 김용욱(정)

경희대학교 화학공학과

A Study on Drown-out Precipitation of ornithine-aspartate by Ethanol

Dong-Myoung Shin, Woon-Soo Kim, Woo-Sik Kim and Yong-Wook Kim

Dept. of Chem. Eng., Kyung Hee University

서론

체내에서 생성되는 아미노산 중 하나인 ornithine은 단백질 신진대사에서 아주 중요한 역할을 하며, 이것의 aspartic acid의 염인 ornithine aspartate는 간장치료제의 원료로 사용되는 물질로 유전자 조작에 의한 발효공정에 의해 제조되는 신약물질이다[1]. 여러가지 precipitant를 이용해 단백질 또는 아미노산을 침전시키는 방법은 단백질의 회수와 분리에서 아주 중요한 분야로 오래전부터 연구되어 왔으며, 그 중에서 ethanol과 같은 유기용매의 비를 이용해 용매의 유전상수를 조절하여 단백질의 용해도를 감소시키는 침전법이 단백질 분리에 널리 쓰이고 있다[2].

본 연구에서는 ethanol을 이용한 ornithine aspartate의 침전공정에서 주입속도와 교반속도가 회수된 ornithine aspartate precipitate의 입자크기와 회수율에 미치는 영향을 알아보았으며, 이에 선행하여 침전 mechanism을 예측하기 위하여 물과 ethanol의  mixiture에서 ornithine aspartate의 용해도를 측정하였다.

실험

1. 물질

본 연구에서는 ethanol이 유전상수와 ionic strength를 조절하여 침전을 일으키는 ornithine aspartate용액으로 생명공학연구소에서 제공한 ornithine aspartate(pH 6.34,Brix35%)를 불순물을 제거하여 사용했으며, 또한 용해도 실험에서는 L-ornithine L-aspartate(Sigma, U.S.)를 사용했고, 기타 시약은 특급 시약을 사용하였다.

2. 실험장치

실험장치는 Fig.1과 같이 설치했으며, 유속이 5ml/min이상인 경우는 peristaltic pump(Master Flex, No.7520-20)을 이용해 유체를 이동시켰으며, 유속조절은 floating flow meter(Gilmont, F-2265)를 이용하였다. 그리고, 유속이 1.28ml/min이하인 경우는 FMI LAB PUMP(Model RP-G20, Fluid Metering, Inc)을 이용해 유속조절과 유체이동을 동시에 해결하였다. 또한 교반은 교반기(Caframo Ltd, BDC 1850)을 사용했고, 반응기는 Rushton type 표준반응기(working volume 400ml)를 사용하였다[3].

Fig.1. Schematic diagram of experimental apparatus (1.agitator, 2. impeller, 3. Rushton type standard reactor, 4. 3-way valve, 5. flow meter, 6. control valve, 7. by-pass valve, 8. pump, 9. feed reservoir, 10. PSA)

3. 실험

ornithine aspartate의 용해도 실험에서,물에 대한 ethanol의 분율은 0∼100%까지 10%의 scale로 변화시켜가며, 물과 ethanol의 혼합물에 L-ornithine aspartate를 넣고 교반시켰다. 온도는 25℃로 일정하게 유지한 상태로 실험을 진행하였으며, 용해도의 결정은 첫째 육안으로, 둘째 conductivity meter, 셋째 filtering후 여과된 양의 측정, 네 번째로 spectrophotometer를 이용한 여과액의 농도분석을 통해 결정하였다.

그리고, 침전실험에서 working volume은 Rushton 반응기의 크기로부터 400ml로 맞췄으며, ethanol과 ornithine aspartate용액의 부피비율을 2＞1로 고정시켰다. 주입속도는 peristaltic pump를 이용하여 주입할 경우 floating flow meter를 사용하였고, FMI LAB PUMP를 이용하여 주입할 경우 pump자체로 결정하였다. 반응물 주입은 반응기 내에 초기용액 부피가 working volume에 도달할 때까지 이루어 졌으며, 여기에서는 앞의 부피비율에 맞추어 미리 ethanol 266.7ml/min을 반응기에 담고, ornithine aspartate용액을 일정한 유량으로 주입해 working volume에 도달하면, 실험을 종료하였다. 또한 교반속도는 100∼1500rpm으로 변화시켰다.

4. 분석 방법

입자 크기분석은 particle size analyzer(Master sizer/E, Malvern instruments Ltd. 영국)을 이용했으며, obsculation이 12%이상이 되도록 vessel내의 농도를 맞췄고, focus lens는 300mm를 사용했다. 또, 입자분석기 내부의 pump 및 교반의 강도는 일정하게 맞추었다.

반응종결후 여과액을 농도분석법에 따라 흡광도를 측정한 후 검량곡선과 비교하여 원액의 농도와의 차이로 회수율을 결정했고, 여과액의 흡광도 측정은 spectrophotometer(Spectronic 20, Milton Roy Company)를 사용하였다.

결과 및 토의

1. 용해도

Fig.2.는 ornithine aspartate의 물과 ethanol의 비에 따른 용해도 실험 결과이다. ornithine aspartate의 용해도는 ethanol의 부피분율이 증가함에 따라 용해도가 감소하는 경향이 나타났다. 4가지 방법중 육안과 conductivity meter, 그리고 filtering 방법은 용해도가 유사하게 나타났지만, 농도분석법은 다른 방법에 비해 비교적 큰 차이가 나타났다.

2. 입자 크기 분석

Ethanol에 의한 ornithine aspartate의 침전형태는 크게 입자가 뭉치거나, 상분리가 일어나거나, 또는 현탁액 상태등 3가지로 나타났다. 이중에서 본연구에서는 반응기내의 입자크기 분포를 대표할 수 있는 현탁액 상태에서의 반응조건에 대해 입자크기를 측정하였다. Fig.3은 교반속도에 따른 침전 분리된 단백질 입자의 평균 크기를 주입속도에 대하여 나타낸 것이다. Fig.3에 나타나듯 0.37ml/min 과 0.68ml/min의 경우 각각 600rpm과 700rpm으로 바뀔 때와 700rpm에서 1000rpm으로 바뀔 때 평균 입자 크기가 큰 폭으로 작아지는 것을 보였으며, 700rpm과 1000rpm이상에서는 각각 변화의 폭이 작아지는 것으로 나타났다. 또한, 2.28ml/min의 경우는 rpm에 따라 변화량이 적지만, rpm증가에 따라 평균 입자 크기도 증가하는 것으로 나타났다.

3. 회수율

Table 1.은 여러 가지 실험조건 중 대표적인 주입속도와 교반속도에서의 ornithine aspartate의 회수율을 살펴본 것이다. 표에서 보는 것처럼 ornithine aspartate는 98%이상으로 높게 회수되었으며, 교반속도 및 주입속도에 관계없이 일정하였다. 이를 보아 교반속도와 주입속도는 제거율에 큰 영향을 미치지 못하는 것을 알 수 있었다.

Fig.2. The solubility of L-ornithine L-asp-  Fig.3. The effect of impeller speed

artate with ethanol volume change         on the mean particle size of

at 25℃.                                 ornithine-aspartate at 0.37,

0.68, 1.28ml/min.

Table 1. Recovery rate of ornithine-aspartate

reaction condition	recovery ratio(%)
feeding rate 0.37ml/mil 1200 rpm	98
feeding rate 0.68ml/min 1200 rpm	98.8
feeding rate 1.28ml/min 1200 rpm	98.4
feeding rate 5ml/min 1000 rpm	99.6
feeding rate 10ml/min 1000 rpm	99.6
feeding rate 1.28ml/min 700 rpm	99.6
feeding rate 1.28ml/min 1000 rpm	99.5

결론

ethanol을 이용한 ornithine aspartate의 침전공정에서 주입속도와 교반속도의 영향은 다음과 같다.

1. 교반속도가 높고, 주입속도가 낮을수록 ornithine aspartate의 침전물은 suspension형태가 된다.

2. particl size는 주입속도가 0.37ml/min과 0.68ml/min의 경우 교반 속도의 증가에 따라 감소하다가 다시 증가하는 경향이 나타났으며, 1.28ml/min의 경우는 미량으로 증가하는 경향이 나타났다.

3. 회수율은 거의 98%∼99%가량으로 나타났으며, 회수율은 교반속도와 주입속도에 영향을 받지않았다.

4. ornithine aspartate의 용해도는 물에서의 ethanol분율이 증가함에 따라 감소하      는 것으로 나타났다.

참고문헌

1. N. Irving Sax and Richard J. Lewis: "Hawley's Condensed Chemical Dictionary", 7th, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 859(1987)

2.  M. Y. Y. Chan, M. Hoare, and P. Dunnill: Biotechnol. Bioeng., 28, 387 (1986)

3. Warren L. McCabe, Julian C. Smith, and Peter Harriott: "Unit Operation of Chemical Engineering", 5th, McGraw-Hill, 242(1993)