참굴패각껍질에서 분리정제된 결정내부단백질에 관한 연구

윤승열, 김용완, 최청송

서강대학교 화학공학과

A Study of Purification and Characterization of Intracrystalline Proteins from the Shells of Oyster Crassostrea Gigas

Seung-Yul Yun, Yong-Wan Kim, Cheong-Song Choi

Dept. of chemical Engineering, Sogang University

1.서론

Biomineralization에 대한 이해가 어려운 이유는 단백질이 패각내에서 존재하는 고유상태에 대한 분석이 어렵기 때문이다. 특히 결정내부단백질은 하나의 peptide에서 3∼7가지의 peptide가 혼합된 매우 복잡한 polypeptide의 조성형태를 지니고 있으며 기존에 보고되었던 자료의 polypeptide 조성차이와 분석과정에서의 단백질의 응집, 손실에 대한 가능성으로 인하여 패각내 단백질연구의 일반화 및 특성비교를 어렵게 하였다.  현재까지는 결정성장억제재로서의 결정내부단백질의 역할이 알려져있고 살아있는 유기체의 패각에서 추출한 단백질은 결정성장을 자극하는 기능에 대한 연구도 보고되었으며 결정내부단백질에는 패각형성에 대해 한가지 이상의 기능이 존재한다고 생각된다. 결정내부단백질은 자연의 상태에서는 산성의 특성을 가지고 있으며 상대적으로 소수성이며 cross-linked된 단백질의 혼합물로 이루어졌다. 따라서 패각이 투석된 후 투석막내에 잔류의 가능성이 있으며 성분별로는 Asp의 함량이 주종을 이루게 된다.  투석되어 분리정제된 단백질의 soluble matrix는 용액내에서 응집하려는 경향을 갖고 있는 서로 다른 거대분자를 많이 함유하고 있다.  여러가지 chromatographic 접근을 통하여 결정내부단백질을 분리정제하였으며 특히 패각결정구조를 결정하는 특정한 아미노산조성 특성을 갖는 균일상의 분리에도 성공하였다.  본 연구에서는 참굴패각내에서 결정구조와 형태가 다른 네가지 부위를 기계적으로 분리하였으며 이들 층으로부터 분리정제된 결정내부단백질의 분리특성과 조성을 비교하였다.  특히 전기영동을 통하여 각층에서 존재하는 분자량 분포를 조사하였으며 각 층에 선택적으로의 존재하는 분자량을 분획하여 아미노산조성분석과 배열을 분석함으로서 패각의 결정학적 구조에 미치는 영향 및 결정내부단백질의 실체를 규명하였다.

2.실험

참굴패각을 6% KOH 용액에 4시간 함침시킨 후  증류수를 이용 여러번 세척하고, sonication(Branson Sonifier)으로 약 1분간 세척하였다. 또한 mini-grinder를 이용하여 분리된 패각의 calcite층과 aragonite층의 확인은 powder-XRD를 이용하였다. 층분리된 패각의 안층, 중간층, 바깥층 그리고 myostracum을 각각  30g씩 준비하여 200□ 증류수(Milli-RO/Milli-Q water purification system)와 혼합한다. 층별 투석액을 10□, 2% 초산을 이용하여 투석(SIGMA dyalysis tubing 12,000-14,000 molecular weight cut-off)하였다.  투석액이 모두 투석된후(48h),  원심분리기(Dupont Instrument, Newton, CT)를 이용(15,000g,  10분)하여  soluble matrix와 insoluble matrix로 분리하고 soluble matrix를 초순수 물을 이용,  4℃에서 재투석하였다.  물을 여러차례 갈아주며 투석한 후(72h) 다시 원심분리한 후, 동결건조(Labconco Freeze dryer)하여 -4℃에서 보관하였다.  동결건조된 단백질을 20mM Tris base(pH 8.0) 완충용액에 3∼5□/□가 되도록 용해시켰으며 원심분리(15,000g, 10min)후 0.45□ filter를 이용, degassing하였다. Gel filtration은 UV detector(wavelength 280nm)와 Superdex 200 column (Pharmacia, HR 10/30)를 이용하여 수행하였으며, 같은 완충용액으로 equilibrate시켰다.  이 용액을 500□씩 주사하였고 유속은 0.5□l/min이었다.  또한 아미노산 조성분석을 위해 동결건조된 단백질을 100□ 증류수에 현탁한 후 20□씩 취하여 완전히 말린다. 시료를 110℃에서 24시간동안 6N HCl을 이용하여 진공에서 가수분해하였다.  가수분해된 아미노산을 PITC(phenylisothiocyanate)로 유도체화시킨다. 시료를 완전히 말린후  pH6.3, 200□의 1.4mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH3CN에 녹인다.  microcentrifuge시킨후 상층액을 각각 50□씩 따서 합쳐 섞은 후 HPLC(Waters PicoTag System)의 autosampler에 안치시킨다.  사용한 column은 PicoTag이며 Photodiode array detector(Waters 990 254nm)를 사용하였으며 60% CH3CN으로 선형 gradient를 사용하였다. 또한 gel electrophoresis apparatus를 이용하여 각층의 분자량분포를 확인하였으며 protein sequencer (ProSequencer 6600)를 통해 아미노산 서열을 분석하였다.

3.결과 및 고찰

여러가지 분자량분포를 가지는 결정내부단백질을 SDS polyacrylamide gel electrophoresis를 이용, 띠의 형태로 가시화하려는 노력은 어려움이 많았다.  전통적인 staining 방법은 패각의 결정내부단백질을 staining하지 못했으며  특히 Coomassie Blue는 gel내에서 아주 미약하거나 어떠한 띠도 형성하지 못했다.  이것은 참굴의 결정내부단백질과 Coomassie Blue가 강하게 반응하지 못하기 때문이다.  이러한 staining의 어려움은 단백질의 대부분이 carbohydrate이거나 또는 가용성 단백질의 일부분을 차지하는 carbohydrate가 Coomassie에 의한 staining reaction을 방해한다는 것을 의미한다.   cationic carbocyanine dye인 Stains-all은 패각의 결정내부단백질과 강하게 반응한다고 알려졌으며 붉은색에서 파란색으로의 색깔변화를 보인다.  따라서 aspartic acid가 다량 존재하는 결정내부단백질의 분자량분포의 특성을 살펴보기 위해서는 cationic dye인 stains-all을 사용해야한다.   160D-180kD에 해당하는 분자량을 갖는 참굴의 결정내부단백질은 많은 문헌에 참고된 값과 비슷한 경향을 보였다.

각층에 침입되어 있으며 층별 고유의 결정구조 변화의 핵심역할을 하는 결정내부단백질을 규명하기 위해 층별로 분리되어 투석된 결정내부단백질을 mild acid hydrolysate를 이용, 조성 분석하였다.  이것으로서  polypeptide chain을 따라 칼슘과 결합가능한 자리의 배열에 대한 정보를 얻을 수 있다.  단백질은 110℃에서 24시간동안 6N HCl을 이용하여 진공에서 가수분해되었다.  이러한 실험조건은 단백질을 이루는 아미노산중에서 선택적으로 Asp 양 옆의 사슬을 끊게 되며 PITC로 유도체화하였다.  그림 1은 calcite로 이루어진 세층과  aragonite로 이루어진 myostracum에서 추출한 결정내부단백질에 대한 gel filtration결과이다.   세가지층과 myostracum에는 적어도 세가지 이상의 서로 다른 단백질이 존재한다는 것을 알 수 있다.  retention time이 30분, 50분, 70분은 각각의 분자량이 160kD, 2kD, 100D을 나타낸다.  따라서 참굴의 결정내부단백질은 대체적으로 넓은 범위의 분자량 분포를 나타내고 있음을 알 수 있다.  retention time이 30분과 60-70분 사이 peak에서 차이를 보이고 있다.  특히 60-70분 사이의 peak는 약 100D 정도의 적은 분자량분포를 갖는 단백질을 나타내는데 이 peak가 myostracum에서부터 안층,중간층,바깥층 방향으로 계속 변성되어 사라지는 경향을 보이고 있다. 이것은 초기결정형성단계에서 CaCO3와 composite를 이루어 aragonite상 형성에 기여하며 myostracum에 존재했던  단백질이 시간이 경과함에 따라 퇴화되어 사라짐을 보여주는 것이다. 또한 이 결과는 FTIR과 XRD data에서 확인된 myostracum에서만 존재하는 aragonite상이 참굴이 성장함에 따라 calcite상으로의 상변환현상을 뒷받침하는 결과라 할 수 있다.   각 층에서 추출한 단백질에 대한 아미노산 조성 분석에서도 차이점을 확인할 수 있었다.  표 1은 각 층에서 추출된 단백질에 대한 아미노산 조성을 mol%로 나타낸 것이다.  전체적으로 볼 때 각 층 모두 Asp와 Gly이 60%이상 함유되어 있으며 아미노산 조성이 층별로 서로 다른 것으로 미루어 각각의 단백질은 독특한 배향을 가지고 있음을 알 수 있다.  또한 calcite로 이루어진 세층을 비교해볼 때 중간층의 Ser함량이 다른 두 층보다 약 두배이상 높고 상대적으로 Asp과 Gly의 차이가 적었다.  이러한 차이는 바깥층, 안층과 중간층의 결정구조차이를 야기시켰다.  즉, 중간층의 단위셀부피는 382.0Å3인 반면 바깥층과 안층은 392.3Å3, 393.0Å3로서 비슷한 값을 가졌다. 또한, 세층에서는 Asp가 Gly보다 높은 함량을 보이는 반면, aragonite로 이루어진 myostracum에서는 Gly이 35.5 mol%로 Asp의 32.2%보다 높게 나타나는 등 전체적으로 세층과 다른 조성 특징을 보이고 있다. 따라서 이 결과는 retention time이 60-70분에 해당하는 100D의 분자량분포를 갖는 단백질을 많이 함유하고 있는 myostracum의 고체상이 aragonite인 것을 참고한다면 각층에서 다른 조성의 단백질존재 여부가 calcite, aragonite등과 같은 polymorph의 선택적 형성에 큰 영향을 미친다고 생각된다.  또한 gel electrophoresis를 통하여 mollusk shell의 분자량분포를 분석한 연구에서는 calcite층에서 14K, 28K, 35K, 48K, 55K의 분자량분포를 보인 반면 aragonite층에서는 16K, 20K, 31K의 분포를 보였다.  따라서 세층과  myostracum에 존재하는 같은 조성의 단백질은 일반적인 패각의 형성에 기여한다면 각 부위에 특정하게 존재하는 결정내부단백질은 고유의 결정상, 형태, 격자구조등 고유의 고체상형성에 독립적인 기능을 수행함을 알 수 있다.

참고문헌

1. Lowenstam, Heinz A. and Weiner, Stephen(1989) in On Biomineralization, Oxford University Press, New York

2. Albeck, S., et al.(1993), J. Am.Chem.Soc. 115, 11691-11697

3. Berman, A., et al.(1988), Nature 331, 546-548

4. Campbell, K. P.,et al.(1983), J.Biol.Chm. 258, 11267-11273

Amino Acid	myostracum	안층	중간층	바깥층
Asp	32.2	42.4	35.9	37.3
Glu	6.0	4.4	4.8	6.1
Ser	7.0	5.0	10.2	6.7
Gly	35.5	32.9	31.4	30.1
His	0.7	0.0	0.0	0.0
Arg	1.1	1.0	0.6	0.4
Thr	1.6	1.3	1.9	2.3
Ala	2.8	1.3	1.8	2.9
Pro	4.7	3.7	5.5	5.9
Tyr	0.9	2.2	1.9	1.6
Val	1.2	0.8	1.1	1.5
Met	1.5	1.5	1.6	1.6
Ile	0.8	0.4	0.5	0.6
Leu	1.0	0.4	0.7	0.8
Phe	0.5	0.2	0.4	0.5
Lys	1.6	1.8	1.0	1.0
Total	100	100	100	100