수성이상계에서 식물세포배양을 통한 생물학적 변환

최 연 숙, 김 동 일

인하대학교 공과대학 생물공학과

Biotransformation Using Plant Cell Cultures in Aqueous Two-Phase Systems

Yeon-Sook Choi, Dong-Il Kim

Department of Biological Engineering, Inha University, Incheon, Korea

서론

식물세포배양에 의한 생물학적 변환은 세포내 효소를 이용하여 외부에서 공급하는 물질의 구조를 선택적으로 변환시키는 기술로서, 화학적 방법이나 미생물을 이용하는 방법에 의한 생산이 불가능한 식물 유래의 유용물질을 생산하고자 할 경우 높은 효용가치를 지니는 기술이다. 이러한 기술을 이용한 대표적인 생물학적 변환의 실례 중 하나가 Digitalis lanata 현탁배양을 통한 cardenolides의 생물학적 변환이다[1]. Digoxin은 심장질환 치료에 효과적으로 쓰이는 의약품으로서, Digitalis lanata 세포배양을 통한 de novo 합성으로는 생산이 불가능한 식물 유래의 물질이다. 따라서 전구체인 digitoxin을 Digitalis lanata 현탁배양에 첨가하여 digoxin으로 전환시키는 생물학적 변환 기술은 매우 유용하다[2].

목적하는 산물이 일련된 반응의 중간산물로 생성되는 경우, 목적산물이 다른 불필요한 부산물로 전환되는 것을 방지하기 위해서는 생성된 목적산물이 생성 즉시 회수되어야만 하며, 이것이 목적산물의 수율증대를 위해서도 바람직하리라 여겨진다. 따라서 이를 위해서는 in situ extraction의 도입이 불가피하다. 두 가지 친수성 고분자 수용액의 혼합이거나 한 가지 고분자 수용액과 염 수용액의 혼합에 의해 형성되는 수성이상계는 80-95%의 높은 수분 함유량, 낮은 계면장력, 그리고 유기용매에 비해 우수한 생물학적 친화성 등과 같은 특성을 보유하고 있으므로 생물공학적인 이용에 적합한 system으로 여겨지며 in situ extraction process로의 응용을 고려할 수 있다[3,4]. 여러 가지 수성이상계 중에서 polyethylene glycol(PEG)과 dextran에 의해 형성된 수성이상계는 소수성 물질의 추출에 널리 이용되고 있다[5]. 따라서 식물세포를 이용한 digitoxin의 digoxin으로의 생물학적 변환 공정에 PEG/Dextran 수성이상계를 적용시켜, 소수성을 띠는 digoxin의 in situ extraction을 유도하여 궁극적으로 목적산물의 생산성을 증대시키는 것이 가능할 것으로 판단된다.

이에 본 연구에서는, 목적산물의 분배계수와 phase volume, cell growth 등을 고려하여 최종 선별한 수성이상계에서 Digitalis lanata 현탁배양을 통한 digoxin으로의 생물학적 변환의 실행 가능성과 최적의 조건을 확립하기 위한 연구를 수행하고자 한다.

실험

세포 및 배지

Digitalis lanata는 독일 T□bingen 대학의 Dr. Wolfgang Kreis로부터 제공받은 cell line K3OHD 캘러스를, 변형시킨 MS 배지에 현탁시켜 유도한 것으로 10일 간격으로 계대배양하여 유지하였다.

생물학적 변환 반응의 수행을 위해서는 2단계 배양 방식을 이용하였다[6]. 2단계 배양의 생장배지로는 MS 배지를, 생산배지로는 8%(w/v) glucose 수용액을 사용하였다.

수성이상계 준비

8% glucose 수용액을 바탕액으로 사용하여 15%(w/w) PEG 20000 수용액과 4% crude dextran 수용액을 준비 후 각각을 9 g 및 21 g씩 취해 혼합하여 30 g의 수성이상계를 형성한 다음 가압증기멸균하여 생산 system으로 이용하였다.

세포증식 측정

암소의 회전식 진탕배양기에서 120 rpm, 25℃의 조건으로 100 mL 삼각플라스크를 이용하여 생장배지 30 mL에 5 g의 fresh cell을 접종시킨 후 세포의 생장을 관찰하기 위해 dry cell weight(DCW)를 측정하였다. DCW는 따뜻한 증류수로 시료를 30배 희석한 다음 여과하여 60℃ dry oven에서 항량이 될 때까지 세포를 건조시켜 질량을 측정한 것이다.

생물학적 변환

Digoxin 생산을 위한 digitoxin의 생물학적 변환은, 준비된 수성이상계에 10일간  배양한 Digitalis lanata 세포를 8 g의 fresh cell로 접종 후 3일간 배양시킨 다음 30 g/L digitoxin 농축모액을 각 flask마다 200 mg/L이 되도록 첨가하여 digoxin으로의 전환을 유도하였다.

Cardenolides 추출 및 분석

Cardenolides의 분석을 위해 기질 접종 후 일정 시간 간격으로 sample을 취해 배양액과 동량의 methanol을 가하여 30분간 초음파 파쇄 후 상등액을 0.45 □ 막여과지로 여과하여 분석시료를 준비하였다.

분석기기로는 오롬테크 Vintage 2000 LC HPLC와 Phenomenex Curosil-G column을, 그리고 이동상으로는 acetonitrile : water (33 : 67, v/v) 혼합용액을 이용하여 1 mL/min 유속으로 220 nm 검출파장에서 UV detector를 사용하여 준비된 시료를 분석하였다.

결과 및 토론

이상계 형성이 가능한 다양한 조성의 PEG/Dextran 이상계에서, 구성 고분자들의 분자량과 농도에 따른 cell, glucose, digitoxin, digoxin 각각의 분배 경향을 관찰하여 Digitalis lanata 현탁배양에 의한 생물학적 변환에 유용하게 이용할 수 있는  수성이상계를 선별하였다. 또한 경제적인 요인도 고려하여 최종적으로 합성비가 질량(g)으로 1 : 2.33인 15% PEG 20000 / 4% crude dextran system을 채택하였다. 본 연구에서 사용한 이 system은 3.4 : 1 (top phase : bottom phase)이라는 부피비를 보였으며 1.7이라는 분배계수를 나타냈다. Table 1은 본 system의 물리적 특성을 관찰한 결과이다.

Table 1. Physical properties of 15% PEG 20000 / 4% crude dextran system

Samples			Viscosity [cp]	Osmolarity [mOsm/kg H2O]
MS medium			1.77	301
8% glucose solution			1.74	470
15% PEG	MS medium		87	643
	8% glucose		91	1014
4% crude dextran	MS medium		352	358
	8% glucose		362	540
15% PEG / 4% crude dextran	MS medium		25	395
	8% glucose		44	616

Fig. 1. Cell growth curves in PEG, crude dextran, and PEG/crude dextran systems

15% PEG 20000 / 4% crude dextran system에서 Digitalis lanata의 생장을 관찰하였다(Fig. 1). PEG나 crude dextran 각각의 수용액상에서는 세포의 생장이 control에 비해 저조한 결과를 보이나 이 두 고분자 수용액의 혼합으로 구성된 수성이상계에서의 세포생장은 control과 유사한 경향을 보였다. 따라서 본 연구에 쓰인 system은 Digitalis lanata 생장에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

Fig. 2. Biotransformation using Digitalis lanata cell suspension culture in aqueous            two phase system

본 system에서 Digitalis lanata 현탁세포배양을 통한 생물학적 변환을 수행한 결과는 Fig. 2에 나타낸 바와 같다. 예상과 달리 수성이상계에서는 대조구에 비해 비교적 낮은 digoxin 생산 결과를 보였다. 이는 본 수성이상계가 큰 점도를 지닌 고분자들로 구성되어 있다는 점을 고려하여 이 실험결과의 원인을 높은 점도로 인한 세포로의 원활하지 못한 산소 공급과 물질 전달 때문인 것으로 생각된다. 이러한 문제점의 해결을 위해 교반 배양기의 회전수를 높여 생물학적 변환을 수행하였다(Fig. 3). 그 결과, 증가시킨 회전수에서 수행한 생물학적 변환의 실험결과가 대조구보다 향상되었음을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 충분한 mixing에 의한 세포로의 원활한 산소 공급과 물질 전달에 기인하는 것으로 사료된다.

Fig. 3. Biotransformation using Digitalis lanata cell suspension culture in aqueous            two phase system at 150 rpm

이상의 결과들로부터 Digitalis lanata 현탁배양에 의한 생물학적 변환에 수성이상계를 이용할 경우, 세포의 생장에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 목적산물인 digoxin을 생산하는 것이 가능함을 알 수 있었으며 생산조건의 최적화에 대한 연구가 지속적으로 진행된다면 목적산물의 수율 증대를 도모할 수 있을 것으로 기대된다.

참고문헌

1. D□ller, P.C. and Reinhard, E.: Planta Med., 37, 277(1979).

2. Kreis, W. and Reinhard, E.: J. Biotechnol., 26, 257(1992).

3. Andersson, E. and Hahn-Hagerdal, B.: Enzyme Microb. Technol., 12, 242(1990).

4. Kaul, R. and Mattiasson, B.: □Extractive Bioconversions in Aqueous Two-Phase       Systems□, Mattiasson, B. and Holst, O.(Eds.), Marcel Dekker, New York(1991).

5. Kaul, R. and Mattiasson, B.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 24, 259(1986).

6. Kreis, W. and Reinhard, E.: Planta Med., 54, 143(1988).