Recombinant Bacteria DPD2540을 이용한

membrane에 미치는 독성 탐지용 Biosensor 특성 연구

최수형, 민지호, 김중현, 구만복, Shimshon Belkin*, Robert A. LaRossa↗

광주과학기술원 환경공학과, *Environmental Sciences, The Hebrew University, Israel.,↗Central Research and Development, DuPont Company, USA.

A Characterization of Biosensor using Recombinant Bacteria DPD2540

for Detecting Membrane-damage stress

Sue Hyung Choi, Ji Ho Min, Jung Hyun Kim, Man Bock Gu,

Shimshon Belkin*, Robert A. LaRossa↗

Dept. of Environ. Sci. & Eng., KJIST, Kwangju, Korea, *Environmental Sciences, The Hebrew University, Israel.,↗Central Research and Development, DuPont Company, USA.

서 론

현재 상,하수도 물이나 환경오염 및 식품류의 탐지나 계측에 사용되고 있는 분석방법들은 너무 비용이 많이들고 그 분석기간이 오래걸림으로 독성정도를 확인하는데 많은시간이 소요되는 약점이 있다(1).  더구나 이들 방법들이 정량 및 정성적인 분석을 통해서 특정물질의 존재유무나 그 정량적인 양을 계측할 수는 있지만 그 시료가 보여주는 독성을 측정하지는 못한다. 따라서 샘플이 함유하고 있는 유해 화학물질의 독성을 빠른시간안에 측정할 수 있는 새로운 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 이에 부응하여 E. coli의 stress에 반응하는 promoter와  V. fischeri의 bioluminesence(lux) 유전자를 연결한 재조합 plasmid를 개발하였으며 이는 stress 정도를 lux 유전자의 발현을 통한 빛의 방출정도로 신속 정확하게 측정할 수 있으므로 매우 효율적인 biosensor로 각광받고 있다(2,3,4). 본 연구에서는 Membrane damage에 작용하는 FabA Promoter와 V. fischeri의bioluminesence(lux) 유전자를 연결한 DPD2540에 대한 stress 반응의 특성을 연구하였다.

이 론

DPD 2540  (pFabALux6/RFM443)이 가지는 FabA promoter는 성장에 절대적인 불포화지방산 합성에 관여하는 4-hydroxydecanoyl-ACP dehydrase에 작용하는 유전자로 지방산 분해를 억제하고 합성을 유도하는 fadR에 의해서  조절되어 진다. 따라서 membrane이 damage를 입어 새로운 fatty acid의 합성이 요구되게 되면 FabA promoter가 작동하고 luciferase가 생성되어 빛을 방출하게 된다.

실험방법

본 실험에서는 E. coli의 heat shock promoter (FabA)에 V. fischeri의 lux system을 reporter gene으로 삽입시킨 plasmid를 함유하는 DPD2540(E. coli strain)을 사용하였다. 이 균주는 Luria-Bertani (LB) 배지 상에서 30 ℃, pH 7.5, 300 rpm의 조건으로 shaking incubator (Forma Scientific)에서 배양하였다.  100 mL의 LB배지에서 12 시간정도 자란 균주의 2 mL씩을 각 플라스크에 접종하고 지수성장기 중간시점에서 독성물질을 첨가하여 Bioluminoscene의 반응을 측정하였다. 이때 방출되는 빛의 세기는 luminometer (TUNER TD-20e)로 측정하였으며 균체의 성장정도는 UV/vis spectrometer (PERKIN ELMER) 상에서 A(600nm)로 측정하였다. 본 내용에서 사용된 SBL(Specific Bioluminescene)은 Bioluminescene를 OD600으로 나눈값을 의미한다. 실험에 사용된 화학물질은 99.9 %의  ethanol (Hayman Limited)과 99.9 %의 phenol류 (sigma등) 로부터 원하는 농도로 희석하여 사용하였다. acetic acid에 의한 실험에서는 aceticacid의 pH를 10N NaOH로 중성으로 적정 한 후 첨가 하였다. 모든 회분식 배양 실험에서 plasmid 보존을 위해 25 □g/mL의 kanamycin (sigma)을 첨가하였다.

결과 및 토론

Stress물질에 대해 어느한도까지는 빛의 증가를 보이나 그 한계 이상의 농도에서는 cellular metabolism 자체가 저해되어 빛의 방출이 감소된다.

Ethanol의 경우

1%와 3 %의 ethanol에 있어서는 대조군과 비교해서 낮은 세포성장 저해를 보이면서 빠르고 연속적인 SBL의 증가를 보이고 있다. 반면 5 %, 7 % ethanol은 cellular metabolism 자체를 저해하여 대조군보다도 낮은 수준으로 유도되는 SBL반응을 보이고 있다.

Cerullenin의 경우

Cerulenin은 fatty acid 합성에 관여하는 □-ketoacyl-ACP synthase I, II 의 작용기를 비가역적 공유결합으로 변형시키는 비경쟁적 저해를 통해서 세포성장을 저해시키는 물질이다. 앞의 이론에서 설명한 바와 같이 fatty acid 의 합성이 필요할 경우에 작동하는 FabA promoter는 cerulenin에 의한 membrane damage에 의해 turn on 되어 lux gene을 발현함으로 빛을 방출하게 된다.  본 실험에서는 cerulenin의 농도가 25 ppm, 50 ppm, 75 ppm으로 증가할수록 SBL값이 증가하였다.

H2O2의 경우와 Mitomycin C의 경우

DPD2540은 산화제인 과산화수소에 의해서는 미미한 정도의 stress 반응을 보이고 있다. 이는 과산화 수소에 의한 membrane이나 fatty acid damage가 미비하기 때문으로 FabA promoter의 작동이 저조하기 때문이다.

Mitomycin C는 DNA에 Damage를 주는 chemical로써 fatty acid damage에 반응하는 DPD 2540에 대해 농도가 증가함에 따라 SBL의 증가를 보였으나 그 양은 membrane에 직접 해를 주는 chemical에 비해 미미한 결과이다.

Phenol류의 경우

Phenol의 경우 먼저 cell의 표면에 흡착한 다음 cell membrane을 통과하여 내부로 들어가게 된다. cell membrane은 phenol의 통과과정에서 damage를 입게되고 새로운 fatty acid의 합성을 요구하게 되어 FabA promoter가 작동하게 된다. 이때 고농도의 phenol을 통과과정에서 membrane을 파괴하고 cell을 죽이게 되므로 biosencing cell은 stress에 반응하지 못하고 죽게 되지만 상대적으로 낮은 농도의 phenol은 cytoplasmic membrane에 있는 phenolic substance에 가역적인 흡착에 의한 저해작용에만 관여함으로 biosencing cell의 cellular metabolism의 저해 없이 cell 로 하여금 stress에 반응하게 한다. 여러 종류의 phenol에 대한 stress 반응은 다음과 같으며 phenol 유도체에 따라 달라지는 최고 농도와 SBL 값은 그들의 산도에 따른 membrane의 투과정도에서 기인 한 것으로 보인다.

위의 결과를 종합하면 DPD2540은 fatty acid (Membrane) damage에 민감하게 반응하는 biosencing cell로서 phenol류의 독성탐지에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

Table 3. Summary of dose response results for DPD2540  induced by                   different Phenol derivaties

Chemical	Maximum conc.(ppm)	Maximum SBL	pKa(25℃)
Phenol	513 ppm	15,620	10
o-cresol	150 ppm	7,712	10.29
4-chlorophenol	75 or 100 ppm	5,167	9.38
2-chlorophenol	50 ppm	4,851	8.48
4-nitro phenol	30	650	7.15
2,4-dinitrophenol, pentachlorophenol	- -	- -	4.09 4.7

Acetate 효과

우리는 앞의 실험 결과들을 통하여 stress 반응이 강할 경우에 넓은 폭의 하나의 peak만 발견이 되지만 stress 반응이 약할 경우 2개의 분리된 peak이 나타나고 있음을 확인하였다. 특히 뒤의 peak는 control에서 나타나는 peak의 시간과 일치함을 확인하였으며 이 시간대의 배양환경이 특별한 induction이 없는 환경에서도 cell에게 stress를 주고 있는 것으로 생각되었다. 그 확인 실험으로 배지의 성분을 시간대로 GC 로 분석한 결과 세포가 성장함에 따라 배지 내에 acetate가 축적되고 이는 cell에게 toxic한 효과로 작용하여 SBL의 증가를 가져오고 있음을 확인하였다. 일반적으로 산성에서 보다 독성을 나타내는 acetate는 이것이 배지 중에 축척 되었을 경우 중성에서도 독성을 나타낸다(5). acetate는 cell의 외부의 pH의 변화 없이 내부의 pH만을 변화시켜 독성으로 작용하는데(5) pH를 NaOH 로 중성화시킨 acetic acid를 첨가하여 독성 실험을 한 결과 1500 ppm에서 최대값인 450 ppm을 나타내었으며 농도에 따라 다른 정도로 반응함을 확인하였다. 따라서 cell내에 축척되는 acetate는 stress반응을 유발하는 chemical임을 확인하였다.

위의 결과를 종합하면 DPD2540은 fatty acid (Membrane) damage에 민감하게 반응하는 biosencing cell로서 phenol류의 독성탐지에 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 사료된다.

참고문헌

1. Bulich, A.A.  A Practical and Reliable Method for Monitoring the Toxicity     of Aquatic Samples. Process Biochemistry 1982, 17, 45-47.

2. Stewart, G.S.A.B.; Williams, P. lux genes and The Application of Bacterial     Bioluminescence. Journal of General Microbiology.  1992, 138, 1289-1300.

3. Man Bock Gu, Prasad Dhurjati, Tina Van Dyk, and Robert LaRossa. 1996.    "A Miniature Bioreactor   for sensing toxicity using recombinant              bioluminescent Escherichia Coli", Biotechnology Progress   12: 393-397.1.

4. Sameer Rupani, Man Bock Gu, Konstantin Konstantinov, Prasad Dhurjati,      Tina Van Dyk, and Robert   La Rossa. 1996. "Characterization of the         stress response of a bioluminescent biosensor in batch and continuous         cultures". Biotechnology Progress 12: 387-392.

5. Gregory W. Luri and William R. Strohl. 1990. "Comparison of Growth,	Acetate Inhibition of Escherichia coli Strains in Batch and Fed-Batch	Fermentation" Applied and Environmental Microbiology,Apr. 1004-1011.

Figure 1. Bimodal response curve of DPD2540  for phenol, H2O2 and            Mitomycin C induction