Humicola insolens로부터 생산된 Avicel 분해 효소의 정제 및 특성연구

류근갑, 김영곤

울산대학교 공과대학 화학공학과

Purification and Characterization of Avicel Disintegrating Cellulases

from Humicola insolens

Keun-Garp Ryu and Young-Gon Kim

Department of Chemical Engineering, College of Engineering, University of Ulsan,

Ulsan 680-749, Korea

서론

Cellulase는 불용성 고분자 물질인 cellulose를 glucose, cellobiose 및 저분자 용해성 cellulose로 분해하며 주로 박테리아와 fungi로 부터 생산되고 있다 (1). 이러한 cellulase를 이용하여 풍부한 자연자원인 cellulose로부터 에탄올 등과 같은 유용한 물질을 생산하기 위한 방법이 연구되어 왔으며, 최근에는 폐지재생공정에서 섬유의 탈수성 개선, 재생펄프의 물성 향상 및 탈묵효율의 증가등을 목적으로 cellulase를 이용하는 방법이 연구되고 있다 (2, 3). 특히 cellulase를 이용한 탈묵방법은 기존의 물리화학적 탈묵방법에 비하여 화학물질의 사용량을 감소시킴으로서 오염물질의 배출량을 줄이고, 기계적 마찰정도를 줄여 재생펄프의 물성을 향상시킴으로서 펄프의 재사용 횟수를 증가시키고 결과적으로 천연펄프를 제조할때 초래되는 산림자원의 훼손을 줄이는 등 환경문제의 해결에 매우 중요한 역할을 하게될 것으로 기대되고 있다 (4).

상업용 cellulase들은 대부분 여러종류의 cellulase가 혼합되어 있는 조효소 형태로 개발되어 있다.  그러나 폐지재생공정에 이들 상업용 조효소를 이용할 경우 조효소에 포함되어 있는 exoglucanase와 endoglucanase사이의 synergism효과에 의해서 결정형 cellulose인 펄프가 분해되는 것으로 알려져 있다 (2). 따라서 cellulase에 의한 펄프의 분해를 최소화 하는 동시에 탈묵효과를 높일 수 있는 효소의 개발이 필요하다.

본 연구에서는 폐지재생공정에 이용할 목적으로 Novo Nordisk사(덴마크)에서 Humicola insolens로부터 생산하여 상업화 한 조효소인 Novozyme 342로부터 결정형 cellulose인 Avicel의 분해능력이 큰 두 종류의 순수한 cellulase를 정제하여 이들 효소의 반응특성과 Avicel에의 흡착성과의 상관관계를 조사하였다. 여러 가지 반응조건 (반응온도, 반응 pH 등)에서 효소의 Avicel 분해활성의 변화에 대한 연구결과는, cellulase를 이용한 폐지재생 공정에서 펄프의 분해를 최소화 할 수 있는 반응조건을 수립하기 위하여 응용될 수 있을 것으로 생각된다.

실험

조효소로서는 Novo Nordisk사 (Denmark)에서 Humicola insolens의 배양에 의해 생산한 Novozyme 342를 사용했다.

Cellulase에 의한 CMC 및 Avicel의 분해활성은 효소반응에 의해서 생성된 환원당을 dinitrosalicylic acid (DNS)방법을 이용하여 측정했으며 (5), 1 분당 1 □mole의 환원당을 생성할 때 1 unit으로 정의하고 표준곡선은 glucose를 이용해서 구했다.

효소의 순도 및 분자량을 측정하기 위해서 Laemmli의 방법 (6)에 따른 SDS-PAGE방법을 이용하였다. Slab gel은 4% polyacrylamide (PAA) stacking gel과 14% PAA resolving gel로 구성하였다. 효소는 2% SDS와 10% mercaptoethanol을 포함하고 있는 용액에서 3분간 끓인 후 분석했다. 전기영동은 20 mA에서 2∼3시간 수행하였고 전기영동 후 단백질 band는 Coomassie brilliant blue R-250로 염색하여 확인하였다.

정제된 cellulase의 활성화 상태에서의 분자량 측정 및 papain과의 반응생성물은 HPLC를 이용해서 측정하였다. 분리column으로는 HPLC용 gel filtration column인 TSK-Gel G3000SWXL (7.8x30 cm, Tosho Co., Japan)을 사용했고 단백질은 280 nm에서의 흡광도로부터 측정했다. Mobile phase로서는 0.05% NaN3, 0.1 M Na2SO4 및 0.1 M KH2PO4를 포함하고 있는 수용액 (pH 6.5)을 0.7 혹은 1 mL/min의 유량으로 사용했다.

결과 및 고찰

Avicel 분해효소의 정제

조효소인 Novozym 342로부터 Avicel 분해활성이 있는 두종류의 cellulase인 Avicelase-I 과 Avicelase-II를 정제하는 방법은 Fig. 1과 같다.

정제된 효소들의 분자량은 SDS-PAGE 와 HPLC방법을 이용해서 측정하였다. Avicelase-I의 경우 SDS-PAGE방법에 의해서 구한 풀린상태에서의 분자량은 63 kDa으로서 Trichoderma reesei에서 정제된 exoglucanase인 CHB I의 분자량 68 kDa (SDS-PAGE분석결과)과 비슷했으며 (6) HPLC방법에 의해서 구한 활성상태에서의 분자량은 약 55 kDa이었다. 반면에 Avicelase-II의 분자량은 SDS- PAGE 및 HPLC분석결과 각각 44.5 kDa과 44 kDa으로서 Avicelase-I보다 작은크기의 효소임을 알았다. Avicelase-I 과 Avicelase-II의 pI값은 chromatofocu- sing column (PBE94)으로부터 용출될때의 용액의 pH값으로부터 구하였으며 각각 4.95와 5.35였다.

Avicel 분해효소의 반응특성 및 안정성

반응용액의 pH 변화 (pH 3-10)가 정제된 효소의 CMC 및 Avicel분해활성에 미치는 영향은 Fig. 2와 같았다. pH 4-10의 범위에서 24시간 경과 후에도 각 효소의 활성은 대부분 초기활성의 약 75%이상을 보임으로서 안정성이 우수함을 알수 있었으며, Avicelase-I이 Avicelase-II에 비하여 CMC 및 Avicel 분해활성이 약 4배정도 높았다. CMC분해활성은 두 정제효소 모두 pH 5에서 가장 높았으며 Avicel분해활성은 Avicelase-I의 경우 pH 5에서 가장 높았고 Avicelase-II의 경우는 pH 4-10의 범위에서 크게 변화하지 않았다.

각 효소반응의 최적온도를 알아보기 위하여 30∼70oC 범위에서 효소활성을 측정하였다. Avicel 분해활성의 경우 Avicelase-I은 55oC에서 최고의 활성을 보였으나 Avicelase-II는 40oC에서 최고의 활성을 보였다. 특히 Avicelase-I의 Avicel 분해활성은 반응온도가 50oC일때까지 급격히 증가함을 보였다.  CMC 분해활성의 경우, Avicelase-I 과 Avicelase-II는 각각 55oC와 50oC에서 최고의 활성을 나타냈다. 위와같은 결과, 반응온도 50oC이상에서 반응용액의 pH값이 4-10 사이일 경우 Avicel분해활성의 대부분이 Avicelase-I에 의한 것임을 보여주었다.

Avicel 분해효소의 흡착특성

정제된 각 효소를 0.2∼2.0 mg/mL의 범위에서 포함하고 있는 완충용액 (50 mM sodium acetate, pH 5.0) 1 mL에 Avicel 10 mg을 투입하고 30℃에서 교반하였다. 30분 후 원심분리에 의해서 여액을 취하고 반응 전후의 단백질의 양을 280 nm에서 흡광도로서 측정하였다. Avicelase-I은 포화식을 따르는 것으로 밝혀졌으며 Avicelase-II는 포화되지 않았다(Fig. 3). Avicelase-I의 흡착분배상수 R은 0.180 mL/mg 이었으며, Avicelase-II의 흡착분배상수값은 0.0256 mL/mg으로서 Avicelase-I보다 작았다. 이러한 결과는 Avicelase-I의 경우 Trichoderma reesei에서 정제된 exoglucanase인 CBH I과 같이 활성부분과 흡착부분으로 나뉘어진 분자구조를 가질 가능성을 볼 수 있었다.

참고문헌

1. Wood, W. A. and S. T. Kellogg, eds., Acedemic Press., Vol. 160(1988).

2. Stork, G., H. Pereira, T. M. Wood, E. M. Dusterhoft, A. Toft, and J.

Puls, Tappi J., 78(2), 79-88(1995).

3. 김동원, 정영규, 장영훈, 손기향, 11(6), 718-725(1996).

4. Pommier, J. C., G. Goma, J. L. Fuentes, and C. Rousset, Tappi J.,

73(12), 197-202(1990).

5. Wood, T. M. and K. M. Bhat, (W. A. Wood and S. T. Kellogg, eds.),

Methods in Enzymology, Vol. 160, p.87, Academic Press(1988).

6. Laemmlie, U. K., Nature, 227, 680-685(1970).

7. Baker, J. O., D. J. Mitchell, K. Grohmann, and M. E. Himmel, ACS Sym-

posium Series 460, pp.313-330, Am. Chem. Soc., Washington D.C(1991).

Figure 1. Overall purification steps of two Avicel disintegrating cellulases from a crude cellulase from Humicola insolens.

Figure 2.  Dependence of Avicel (A) and CMC (B) disintegrating activity and stability of the two purified cellulases on solution pH. Buffers (50 mM) used were sodium citrate, pH 3.0; sodium acetate, pH 4∼5; sodium phosphate, pH 6∼7, Tris-HCl, pH 8; glycine, pH 9∼10. Activity was measured at 50oC. (○), Initial activity of Avicelase-I; (●), activity of Avicelase-I after 24 hr at 30oC; (□), initial activity of Avicelase-II; (■), activity of Avicelase-II after 24 hr at 30oC.

Figure 3. (A). Adsortion on Avicel of Avielase-I(●) and Avicelase-II(○). Solutions containing different enzyme concentrations (0.2∼2.0 mg/mL) and 1% (w/v) Avicel in 50 mM sodium acetate (pH 5.0) were agitated for 30 min at 30oC for adsorption. (B). Langmuir plot of the adsorption of Avicelase-I on Avicel.