간세포 구상체의 고정화 기술 개발

이두훈, 김성포, 양성문, 박정극

동국대학교 공과대학 화학공학과

Development of Hepatocyte Spheroids

Immobilization Technique

Doo-Hoon Lee, Sung-po Kim, Sung-Mun Yang, Jung-Keug Park

Department of Chemical Engineering Dongguk University

서론

간세포의 단층배양보다는 세포가 구형태로 3차원적인 집합체를 이루도록 하는 spheroid 형태로 배양하는 것이 간세포 및 조직의 morphology와 생존력, 간기능면에서 우수함이 국외 연구 현황을 통해 증명되었다.(1) 그러나 이 간세포의 spheroid는 정체된 배양상태에서는 그 간기능면에서 우수한 활성을 보였으나 결국 인공간 개발을 위해서는 이를 scale-up해야 하기 때문에 일반적인 suspension 방식의 생물 반응기에서 배양하는 경우 공정상의 교반 및 흐름 등으로 유발되는 shear의 발생에 의해 간세포 spheroid의 손상을 초래한다.

따라서 본 연구의 목적은 shear에 의한 손상을 막으면서도 물질전달에 저항이 걸리지 않도록 하기 위해서 간세포에 매우 적합한 세포외 기질로 알려진 collagen gel(2)에 간세포 spheroid를 embedding시켜 고정화시킨 후, 부유반응기에서 배양하는 기술을 개발하는 것이다. 즉 간세포를 최적상태의 간세포 spheroid로 구성한 뒤 이를 collagen이나, collagen-alginate 용액에 분산시킨 후 구형의 액적을 형성한 다음 encapsulation해서 고정된 스페로이드를 suspension반응기 내에서 배양하는 것이다.

재료 및 방법

쥐 간세포의 분리

간세포의 분리는 Seglen-method(2)에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하는 데 이는 in situ상태에서 2단계로 시행하는 collagenase perfusion 테크닉으로서 그 방법은 다음과 같다(3). 180-200g 정도 무게를 갖는 rat을 케타민(0.1mg/rat 100g)과 럼푼(0.01ml/rat 100g)을 주사하여 마취시키고, 해부용 가위를 사용하여 쥐의 복부를 열어 간문맥(portal vein)을 찾아서 catheter를 삽입하고 결찰사로 고정시킨 후 1단계로, calcium-free HEPES 버퍼를 25ml/min의 유속으로 10-15분 흐르게 하여 간을 충분히 세척한다. 2단계로는 0.05%농도의 collagenase가 포함된 넣는 동안 완충용액을 20ml/min의 유속으로 10분동안 흐르게 하여 간조직의 기질부분을 느슨하게 분해한다.

효소처리가 끝난 간을 잘라내어 페트리디쉬에 옮긴 후 수술용 메스로 켑슐을 자르고 거즈와 나일론 매쉬에 거른 후 4회의 원심분리(500rpm 2분)로 간세포만 분리한다. 분리된 간세포를 trypan blue dye exclusion 방법과 hemacytometer를 사용하여 세포농도와 생존도를 측정하였다. 보통 2-3×108 개 정도의 세포가 얻어지며 80%이상의 생존도를 갖는다.

간세포 구상체 배양

Magnetic stirrer가 장치되어 있는 250ml-spinner flask에 일차배양으로부터 얻은 간세포를 5×105cells/ml 농도로 100ml 접종하여 60RPM으로 교반하며 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양한다. 이때의 배지는 홀몬첨가의 무혈청 배지로서 Williams Medium E에 epidermal growth factor(20□g/□), insulin(10mg/□), CuSO4·5H2O(0.1□M), ZnSO4·7H2O(50pM), H2SeO3(3□g/□), HEPES(1.19g/□) NaHCO3(1.05g/□), linoleic acid(50mg /□), penicillin(0.0588g/□), streptomycin(0.1g/□)을 첨가하여 사용하였고, 접종 24시간 후 간세포는 부정형으로 aggregation이 일어나고, 접종 50시간 후에는 aggregation이 일어난 간세포 집합체의 주위 테두리가 일정한 모양의 원형을 구성하여 spheroid가 형성되고, 그 크기는 약 170-230□m이다.

간세포의 고정화 기술

첫번째 방법으로는 collagen(Cellmatrix) 0.3%와 alginate 1.3%가 포함된 Williams Medium E로 간세포 spheroid를 분산시킨 후 23G의 끝이 무딘 주사기 바늘을 통하여 100mM CaCl2용액으로 떨어뜨려 구형의 Ca-alginate bead를 만든다. 이때 멸균된 공기를 바늘 뒤에서 16□/min의 유속으로 불어주어 bead크기를 작게 조절하였다. 형성된 bead는 6-well plate에서 5×105cells/ml의 cell density로 orbital shaker에서 120RPM으로 배양되었으며, bead내의 cell density는 1×106cells/ml이다.

두 번째 방법으로 bovine에서 유래된 불용성 type Ⅰ의 collagen을 아세트산에 녹여 10mg/ml 농도의 collagen용액을 만들어 사용하며, 미리 배양된 간세포 spheroid를 회수하여 pH7.2-7.4의 60mM의 calcium이 든 배지용액과 함께 collagen용액에 넣어 분산시킨 후 23G의 끝이 무딘 주사기 바늘을 통하여 0.5%의 alginate용액으로 떨어뜨려 바깥층에 Ca-alginate 피막을 가진 collagen bead를 만든다. 그리고 37℃에서 30분간 방치하여 collagen을 젤화(gellation)시키고, 이것을 citrate buffer에 10분간 넣어서 물질전달의 저항이 될 수 있는 바깥층의 alginate피막을 녹여낸다.

간세포 구상체의 간기능 활성도 측정

배양된 간세포의 detoxification능력을 조사하기 위하여 암모니아의 분해속도를 아산제약의 indophenol kits를 사용해서 측정하였고, 이에 따른 요소 생성속도는 Blood urea nitrogen assay kit(Sigma Co.)를 사용하여 측정하였다. 암모니아의 제거속도를 측정하기 위해서 배양2일째부터 1mM NH4Cl을 첨가한 배지를 사용하였다. 간세포의 중요한 대사기능의 하나인 알부민의 합성 및 분비는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 사용하였는 데, 1차 항체(IgG fraction to rat albumin), 알부민 표준, 2차항체(Peroxidase-Conjugated IgG fraction to rat albumin)는 OGARNON TECHNIKA CORPORATION시약을 사용하였으며, 1차 항체는 2□g/ml를 2차항체는 1/5000을 사용하였다.

결과 및 토론

간세포 고정화

Bead는 collagen과 alginate의 혼합용액의 bead와 바깥층의 alginate피막을 녹여낸 collagen bead의 2가지 형태이며, 각각에 대해서 single cell과 spheroid를 embedding시켰다.

Fig.1에서 보이는 것과 같이 현미경 관찰결과 bead의 크기는 평균 1200□m정도이며, bead 내 cell density는 1×106cells/ml이고, 기준 배양으로 suspension spheroid를 배양하였다.

간기능 활성도 측정

Fig.2는 암모니아의 제거속도와 요소분비속도를 나타낸 것이다. 1mM의 NH4Cl이 포함된 배지는 24시간후에 첨가하기 시작하였다.

요소 분비속도와 암모니아 제거속도가 suspension spheroid의 경우 4일째부터 급격히 감소하는 데 반해, collagen과 alginate의 혼합용액의 bead는 9일까지 어느정도 유지됨을 알 수 있다. 또한 간세포의 중요한 대사기능의 하나로, 간에서 분비되는 단백질의 40%이상을 차지하는 알부민의 경우, in vitro배양에서 그 기능을 쉽게 잃게 되는데, 이번 연구에서 알부민 분비능은 2주동안 유지됨을 알 수 있다.

이상의 결과로 볼 때 향후 체외 간 보조장치로서 collagen gel bead에 embedding 된 상태의 간세포 spheroid를 인공간 반응기에 충진하는 시스템을 개발할 수 있을 것으로 사료되며, 추후 연구는 간기능 활성도를 적어도 3주동안 초기의 높은 상태로 유지하기 위한 보다 개선된 간세포 고정화기술의 최적화 노력이 더욱 필요하리라 판단된다.

참고 문헌

1. Norio Koide, Takao Tsuji, et.al.,"Formation of Multicellular Spheroids          Composed of Adult Rat Hepatocyte in Dishes with Positively charged         Surface and under Nonadherent Environment" Experimental cell Research,     Vo. 186, 227-235, 1990

2. J.C.Y.Dunn, Martin L.Yarmush, et.al.,"Long-Term In Vitro Function of         Adult Hepatocytes in a Collagen Sandwich Configuration", Biotechnol. Prg.,     Vo.7,237-245,1991

3. Seglen P.O.,"Preparation of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell. Biol., Vol.     13. 29-83, 1975

(B)

(A)

Fig.1 Light microscopic pictures of hepatocytes and hepatocyte spheroid             encapsulated in  collagen-alginate. (A) Hepatocyte in cllagen-alginate         bead  (B) Hepatocyte spheroid in collagen-alginate bead.

Fig.2 Ammonia removal rate, urea and albumin secretion rate of hepatocyte       spheroids cultured as susension and immobilized in collagen-alginate bead.