역상 액체 크로마토그래피에서 이동상의 조성에 관한

분리도의 예측

정용안·노경호·정성택

인하대학교, 화학공학과

Prediction of Resolution with respect to Mobile Phase Compositions

in RP-HPLC

Jung Yong An, Kyung Ho Row, Sung Taik Chung

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

서 론

크로마토그래피는 여러 성분이 혼합되어 있는 물질을 column을 통과 시킴으로써 적절한 시간안에 각각 성분으로 분리하고자 하는 것이 목적이다. 두 peaks 사이의 분리도는 체류시간의 차이와 peak 평균 폭의 비로서 정의된다[1].본 연구에서는 자궁암, 유방암, 후두암 및 백혈병의 치료제로서 탁월한 성능을 가지고 있는 것으로 알려진 taxol과 이와 분리하기 어려운 cephalomannine와 10-deacetyltaxol의 분리도에 관한 실험을 하였다.

Taxol은 주목나무에서 추출되는 taxane diterpene amide로 taxane ring의 구조를 갖는 taxane 화합물을 말한다[2]. Taxol은 미국의 NCI(National Cancer Institute)에서 천연물질중 약리화학적 성분을 선별하는 과정에서 알려졌으며 1980년대 Bristol Myers 등을 비롯한 일부 회사를 중심으로 상업화되기 시작하였다. Taxol은 제한된 천연물질로부터 분리·추출되고 있는데 주요 공급원은 주목나무이다. 생활수준의 향상과 기호의 다양화로 각종 난치성 질병이 사회적인 문제로 대두됨에 따라 taxol의 의학적인 측면을 중심으로 관심이 집중되고 있으며 고순도의 taxol을 대량으로 생산하기 위한 노력이 진행 중에 있다[3].

본 연구의 목적은 주목나무 추출물로부터 얻은 시료를 이용하여 curosil-PFP column(250×4.6mm, 5□)에서 이동상으로 물, 아세토나이트릴, 메탄올 등을 사용하고 이들 용매의 종류와 조성이 변화됨에 따라 taxol의 전구체인 cephalomannine, 10-deacetyltaxol로부터 taxol의 분리도를 나타내는 가장 좋은 관계식을 구하고자 한다. 또한 이 관계식을 이용하여 taxol 분리의 최적조건을 구하고 이를 실험을 통해 확인하고자 하는 것이 본 실험의 목적이다.

실 험

역상 HPLC의 이동상으로는 J. T. Baker 사의 HPLC용 메탄올, 아세토나이트릴, 물을 사용하였다. HPLC는 Waters사의 600E 펌프(multisolvent delivery system), 486 UV-visible tunable wavelength absorbance, U6K 주입기(2□ sample loop)를 사용하였다. 데이터 저장 시스템은 CHROMATE(v.3.0, Interface Eng.)를 사용하였다. 실험에 사용된  column은 분석용으로  curosil-PFP (250×4.60mm, 5□, Phenomenex Co.)을 사용하였다. 시료(주목나무)의 추출은 임목육종연구소에서 제공한 주목나무 분말을 메탄올을 사용한 용액 추출법과 클로로포름을 사용한 용액 분배법을 통해 실험에 사용할 시료를 만들었다. 시료는 주목나무의 추출액과 표준시료로써 NCI로부터 제공받은 3가지 성분(cephalomannine, taxol 10-deacetyltaxol)의 혼합액을 사용하였다. 시료 주입량은 10□이고 이동상의 유속은 1□/min으로 고정하고 일정용매법으로 실험을 하였다. UV 검지는 228nm에서 고정하였다.

결과 및 고찰

물을 기본으로 하는 역상 HPLC에 organic modifier로서 methanol과 acetonitrile을 첨가하였다. 이 organic modifier에 따라서 cephalomannine와 taxol, taxol과 10-deacetyltaxol의 분리도를 다음과 같은 식에 의해서 측정하였다.

[eqn: R~=~{t sub{2}~-~t sub{1}} over {{(w sub{2}~+~w sub{1})}/2}~=~{2△t} over {w sub{2}~+~w sub{1}}]

t1, t2은 시료 1, 2의 체류시간이며, w1, w2은 시간단위로서의 peak 1, 2의 기준선에서의 폭이다.

Acetonitrile, methanol, water의 2성분계 또는 3성분계 조성에 따라 cephalomannine/taxol의 분리도와 전체 실험시간이 Fig. 1에서 보여 주고 있다. Organic modifier(acetonitrile, methanol)의 양이 증가함에 따라서 빠른 용출 시간으로 인해서 분리시간은 줄었고 이에 따라서 분리도는 감소하였다.

분리도를 이동상 조성에 대한 함수의 관계식으로 나타내기 위해서 각 조성의 선형적인 관계식, interaction을 고려한 관계식등을 시도하였다. 아래 Table 1,2에서는 각기 cephalomannine/taxol, taxol/10-deacetyltaxol의 경우에 대해서 equation의 종류에 따른 regression coefficient(r2)을 나타내었다. X1은 vol.% of acetonitrile, X2은 vol.% of methanol, X3는vol.% of water이다.  No. 4의 resolution equation을 이용하여 이동상의 조성에 따른 분리도의 변화를 Fig. 2에서 보여주고 있다. Resolution의 범위를 R<1.5, 1.5<R<6, R>6 세 구분으로 나눠서 비교하였다. 분리도가 증가하면 분리시간이 증가하기 때문에, 이동상의 조건은 분리시간을 1시간이내로 제한하는 경우에는 1.5<R<6 범위에 들게 된다. 삼각형으로 표시된 부분이 만족할 만한 이동상의 조성이 된다. Fig. 3에서는 taxol/10-deacetyltaxol에 대한 이와 비슷한 경향을 보이고 있다.

Table 1.  Comparison of correlation equations tested (cephalomannine/taxol)

No.	Resolution Equations	r2
1	14.613 - 0.187X1 - 0.16X2 - 0.00082X12 - 0.00048X22	0.9868
2	16.458 - 0.266X1 - 0.22X2 + 0.0016X1X2	0.9727
3	37.892 - 1.151X1 - 0.892X2 + 0.0089X12 + 0.0052X22 + 0.0157X1X2	0.9716
4	0.0042 + 0.088X1 - 0.0043X2 + 0.331X3 - 0.013X1X2 - 0.0041X2X3 - 0.0073X3X1 + 0.00029X1X2X3	0.9844

Table 1.  Comparison of correlation equations tested (taxol/10-deacetyltaxol)

No.	Resolution Equations	r2
1	9.531 - 0.132X1 - 0.229X2 - 0.00055X12 + 0.0015X22	0.9349
2	8.464 - 0.139X1 - 0.113X2 - 0.0012X1X2	0.8473
3	12.737 - 0.265X1 - 0.33X2 + 0.0008X12 + 0.0023X22 + 0.0022X1X2	0.9321
4	0.00054 - 0.073X1 + 0.02X2 + 0.106X3 - 0.0073X1X2 - 0.0018X2X3 - 0.000071X3X1 + 0.00013X1X2X3	0.9330

알 림

본 연구는 교육부 생물화학공학 분야 연구과제로 수행 중인 project입니다. 연구가 원할하게 진행될 수 있게 표준시료를 제공해 주신 NCI와 주목나무 분말을 제공해 주신 임목육종연구소에 감사를 표합니다.

참고문헌

1. Nina Hadden, Fred Baumann, Fred MacDonald and Miner Munk: "Basic       Liquid Chromatography", Varian Aerograph (1971).

2. M. C. Wani, H. L. Taylor, M. E. Wall, P. Coggon and A. T. McPhail, J.       Am. Chem. Soc., 93, 2325 (1971).

3. Manfred E. Wolff, "Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery", 5th     Ed., John Wiley & Sons, NY, U.S.A, p.996 (1995).