Recombinant Bacteria를 이용한 독성탐지용 Biosensor 개발

최 수 형·민 지 호·구 만 복

광주과학기술원 환경공학과

A Developement of Biosensor for Detecting Toxic Materials

using Recombinant Bacteria

Sue Hyung Choi·Ji Ho Min·Man Bock Gu.

Dept. of Environ. Sci. & Eng., KJIST, Kwangju, Korea

서 론

Bioluminesent bacteria의 lux system은 유전자 발현과 세포대사정도를 측정하는데 응용되어져 왔다.

최근에는 폐수처리 공장에 유입되는 독성물질로 인한 처리효율 저하를 방지 하기 위해 유입수에 포함된 독성물질 여부를 lux system을 이용하여 확인하려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

세포가 stress를 받게 되면 단백질의 구조 결정에 관여하는 molecular chaperones와 같은 heat shock 단백질을 합성하여 heat shock 반응을 나타내게 되는데, 이러한 stress의 종류로는 온도의 변화, 바이러스의 감염, 에탄올, 페놀, 중금속과 같은 화학물질로부터의 노출을 들 수 있다. 최근 이러한 점에 기초하여 E. coli의 heat shock promoter에 V. fischeri의 bioluminesence(lux) 유전자를 연결한 재조합 plasmid를 개발하였다[1](Fig. 1). 이는 stress 정도를 lux 유전자의 발현을 통한 빛의 방출정도로 신속 정확하게 측정할 수 있으므로 매우 효율적인 biosensor로 각광받고 있다.

본 연구에서는 이러한 bioluminesence를 이용한 biosensor의 화학물질로 인한 stress에 대한 반응을 조사하였다.

Chromosomal DNA                                        Plasmid DNA

SWITCH                         lux genes

(luciferase expression

for light emission)

SWITCHES(promoters) : Protein Unfolding

DNA Damage

Membrane Damage

Oxidation Damage

Fig.1  Bacterial cells biosensing toxicity

이 론

박테리아의 발광 반응은 다음의 과정을 통해 이루어 진다[2.3].

FMNH2 + RCHO + O2 ----> FMN + H2O + RCOOH + hv(490 nm)

lux operon에는 5개의 구조유전자가 존재하며 각각은 luciferase(luxAB), reductase(luxC), transferase(luxD)와 synthetase(luxE)를 지정한다.

이들의 대략적인 반응은 다음과 같다.

RCOX + HOH(HSR') ----> RCOOH(RCOSR') + XH

RCOOH + ATP + NADPH ----> NADH + AMP + PPi + RCHO

여기서 R과 R'은 긴 사슬의 알킬그룹을 의미한다.

실험방법

본 실험에서는 E. coli의 heat shock promoter들 (grpE, recA, FabA)에 V. fischeri의 lux system을 reporter gene으로 삽입시킨 plasmid를 함유하는 DPD2540을 포함하는 E. coli strain들을 사용하였다. 이 균주는 Luria-Bertani (LB) 배지 상에서 30 ℃, pH 7.5, 300 rpm의 조건으로 shaking incubator (Forma Scientific)에서 배양하였다.  100 mL의 LB배지에서 12 시간정도 자란 균주의 2 mL씩을 각 플라스크에 접종하고 지수성장기 중간시점에서 독성물질을 첨가하여 Bioluminoscene의 반응을 측정하였다. 이때 방출되는 빛의 세기는 luminometer (TUNER TD-20e)로 측정하였으며 균체의 성장정도는 UV/vis spectrometer (PERKIN ELMER) 상에서 A(600nm)로 측정하였다. 실험에 사용된 화학물질은 99.9 %의  ethanol (Hayman Limited)과 99.9 %의 phenol (sigma), 99 % o-cresol (sigma)로부터 원하는 농도로 희석하여 사용하였다.  모든 회분식 배양 실험에서 plasmid 보존을 위해 25 □g/mL의 kanamycin (sigma)을 첨가하였다.

결과 및 토론

일반적으로 단백질 구조를 변형시킴으로써 heat shock 반응을 유도하는 것으로 알려진 ethanol과 phenol류에 대한 여러균주들의 반응을 측정하였다. Heat shock 반응의 정도는 volumetric light emission을 세포의 optimal density (OD 600)로 나눈 specific bioluminesence (SBL)로 측정하였다. 이들 화학물질의 경우  어느정도의 농도까지는 비례적인 SBL의 증가를 보이나 어느 한도가 넘어서면 대조군보다도 낮은 수준의 SBL값을 보이고 있다.

Ethanol의 경우

1 %와 3 %의 etanol에 있어서는 대조군과 비교해서 낮은 세포성장 저해를 보이면서 빠르고 연속적인 SBL의 증가를 보이고 있다. 이는 etanol이 heat shock반응을 유도하여 lux reporter gene system에 의해 확인되고 있음을 보여준다. 반면 5 %, 7 % ethanol은 대조군보다도 낮은 수준으로 유도되는 SBL반응을 보이고 있다. 이 경우는 세포성장곡선에서 유추해 볼 수 있듯이 상당한 세포의 성장을 저해하고 있음을 보여준다. 이러한 세포성장 저해는 높은 농도의 ethanol이 cellular metabolism 자체를 저해하여 stress에 반응할 수 있는 세포 자체에 해를 끼치기 때문이다. Ethanol에 있어서 최대 heat shock 반응을 유도하는 농도는 3 %였으며 이때의 최대 SBL값은 7,387 이었다.

Phenol의 경우

57 ppm, 171 ppm, 342 ppm, 513 ppm의 phenol은 농도가 증가할수록 반응되어지는 SBL값도 증가한다. 이러한 증가는 513 ppm을 최대치로 684 ppm, 741 ppm으로 갈수록 감소되다가 결국 1140 ppm에 이르러서는 대조군 보다도 낮은 SBL수준을 나타내었다. 513 ppm까지의 증가는 위에서 언급한 바 있는 stress에 대한 lux system의 작동에서 기인하며 1140 ppm에서 나타낸 낮은 수준의 SBL은 ethnol에서와 마찬가지로 cellular metabolism 저해로 인한 독성효과인 것으로 보인다. 684 ppm과 741 ppm은 513 ppm과 1141 ppm의 중간정도를 나타내고 있으며 이는 stress에 의한 lux system의 유도와 cellular metabolism을 저해하는 독성효과의 조화에서 기인된 것으로 보인다. DPD 2540은 특히 phenol에 민감하게 반응하는 것으로 보이며 513 ppm phenol의 경우 최대 SBL값이 15,620으로 이는 ethanol 최대값의 2 배에 해당한다.

o-cresol 및 다른 phenol류의 경우

Phenol에서와 마찬가지의 경향을 보이며 30 ppm., 50 ppm, 150 ppm의 경우 농도가 증가할 수록 SBL값도 증가하다가 150 ppm, 300 ppm, 450 ppm으로 갈수록 감소하는 경향을 보이고 이는 600 ppm, 750 ppm에 이르러서는 cellular metabolism을 저해하는 독성효과로 인해 대조군보다도 낮은 수준의 SBL값을 나타내고 있다. o-cresol에 있어서의 최대 반응은 150 ppm에서 나타났으며 그때의 SBL값은 7,712로 측정되었다.

이상의 결과에서 알수 있듯이 세포내의 lux system으로 독성물질을 탐지하는데 있어서는 한계농도가 존재한다. 즉, 낮은 독성농도에서 기인된 저조한 SBL수준과 높은 독성농도의 cellular metabolism저해에서 기인된 낮은 SBL사이의 뚜렷한 차이를 규정할 수 없다. 이러한 경우에 있어서는 부가적으로 세포의 성장곡선을 비교하여 성장지연정도를 확인함으로써 이 두가지의 구별을 알아낼 수 있다. 또한 DPD 2540에서처럼 대조군의 stress가 없는 환경에서도 높은 SBL값을 나타내는 경우, 대조군보다 낮은 SBL값을 나타내는 화학물질의 농도는 고농도 독성에 해당하며 이는 cellular metabolism의 저해로 인한 결과이다. 따라서 대조군의 SBL수준이 높을 수록 높은 농도의 독성을 측정하는데 용이하여 bioluminesence의 감도를 증가시키는데 효율적일 것으로 보인다.

참고문헌

1. Van Dyk, T. K., Majarian, W. R., and LaRossa, R. A., Rapid and sensitive pollutant detection of heat shock gene-bioluminesence gene fusions, Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, 1441-1420.

2. Rupani, S. P., Man Bock Gu, Konstantinov, Van Dyk, T. K. and LaRossa, R. A., Charaterization of the Stress Response of a Biological Sence of in Batch and Continuous Cultures, Biotechnol. Prog., 1996, 12, 387-392.

3. Man Bock Gu, Dhurjati, P. S., Van Dyk, T. K. and  LaRossa, R. A., A Miniature Bioreactor for Sensing Toxicity Using Recombinant Bioluminesence Escherchia coli Cells, Biotechnol. Prog., 1996, 12, 393-397.

(a)                                   (b)

Fig. 2 The effect of pulsed of ethanol on (a) cell growth and (b) induced            spscific bioluminesence profiles obtained in a batch flask cultivation in         LB medium at 30 ℃

(a)                                    (b)

Fig. 3 The effect of pulsed of phenol on (a) cell growth and (b) induced            spscific bioluminesence profiles obtained in a batch flask cultivation in         LB medium at 30 ℃