유가식 발효 공정에 적용된 제어 전략들

이정석*, 이상엽*, 박선원*, Anton P.J. Middelberg**

*한국과학기술원 화학공학과,

**Department of Chemical Engineering, University of Adelaide, Adelaide, AS 5005, Australia

Control Strategies Applied To Fed-Batch Fermentation Processes

Jeongseok Lee*, Sang Yup Lee*, Sunwon Park*, and Anton P.J. Middelberg**

*Department of Chemical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology,

**Department of Chemical Engineering, University of Adelaide, Adelaide, AS 5005, Australia

서론

발효의 일차적 목표가 bioproduct의 저비용 생산이므로, 원하는 제품을 고농도, 높은 수율로 생산하는 발효 방법을 개발하는 것이 중요하다. 유가식 발효는 1차 및 2차 대사 산물, 단백질, 기타 생물 고분자 등의 생산을 위하여 널리 이용되어 왔다. 이는, 발효 종료시까지 계속적으로 기질이 공급되는 유가식 발효 방식이 기질 농도 변화가 원하는 제품의 생산성 및 수율에 영향을 미치는 시스템에서는 특히 회분식 발효보다 우수하기 때문이다 [48]. 이러한 유가식 발효에서는 기질의 과다 혹은 과소 공급이 균체 성장과 제품 생산에 큰 영향을 미치므로 적절한 기질 도입 전략의 개발이 특히 중요한 주제가 된다. 그동안 여러 가지 전략들이 제시되어 (i) 정확한 균체 성장 모델을 얻기가 어렵고, (ii) 비선형성이 심하고, (iii) 공정 반응이 느리며, (iv) 중요 변수에 대한 실시간 측정이 어렵다는 등의 문제 [36]에 도전하였고, 많은 성과를 얻었다.

기질공급 제어전략

간단한 간접적 되먹임 방법으로는 기질 공급과 pH 또는 DO 측정치를 연관시키는 pH- stat 또는 DO-stat과 같은 방법이 개발되었다 (그림 1). 즉, pH 또는 DO가 설정치보다 높아질 때마다 on/off 제어기가 기질을 공급한다. 이는 암모늄 이온의 발생에 따른 pH 상승, 또는 기질 고갈에 따른 DO 상승 현상 등을 이용한 것이다 [Lee,1996;Suzuki et al.,1990].

지수 공급 방식은 균주를 일정한 비성장 속도로 성장시키는데 있어서는 간단하면서도 유력한 방법이며, E.coli 등의 고농도 배양에 많이 이용되었다 [Gregory,1993;Lee,1996;Yang et al.,1992;Yoon et al.,1994]. 이는 균체 성장을 저해하는 아세트산의 생성을 최소화할 수 있는데, 여기서는 기질 공급 속도를 결정하는데 단지 균체의 성장 모델식만을 이용하게 된다. 그러나, 이 방법의 기본 전제가 균체의 지수성장이므로 기질의 과다 혹은 과소 공급에 따른 균체 성장의 변화에 대처할 수 없다.

그림 . 간접적 되먹임 제어 방법.

배지내 탄소원의 농도를 실시간으로 측정 가능하다면 원하는 값으로 이를 제어할 수도 있다 (그림 2). 이 방법은 DO, 배출가스 조성, 기질 농도 등의 변수들을 GUR, GD, 기질 전환율로부터 추정한다. Kim 등(1994)은 A.eutrophus의 유가식 발효에서 글루코즈를 실시간으로 측정 제어하였다. 그러나, 측정시간 지연과 측정장치의 불안정성 때문에 기질보다는 그 소비속도를 측정하여 이용하는 방법이 많이 연구되었다. Konstantinov 등(1990)은 이른바 '균형 DO-stat' 방법을 통하여 글루코스의 소비 속도를 일정하게 유지시키는 방법을 제안하였다. 이 방법을 통하여 글루코즈의 축적이나 고갈을 막아 phenylalanine의 생산을 크게 증가시킬 수 있었다. Kleman 등(1991)은 회귀법으로 글루코즈 소비량을 예측하고 (앞먹임) 실시간으로 글루코즈 농도를 측정하여 작은 오차를 줄이는 (앞먹임) 방법을 복합적으로 사용하여 E.coli B를 고농도로 배양하였다. 한편 Hosobuchi 등(1993)은 S.carbophilus의 배양에서 HPLC로 탄소원의 전환율을 예측하는 방법을 연구하였다. 또한 Zhou 등(1995)은 글루코즈와 산소의 소비량간의 양론관계를 이용하여 기질을 공급하는 방법을 제안하였다. 이 방법들에서는 주로 on/off 또는 PID 제어기들이 사용되었는데, 모델 파라미터들이 시간의 함수임을 고려한 제어기들도 개발되었다.

그림 . GUR이나 GD 추정치를 이용한 기질 공급 방법.

앞에서 언급한 몇몇 연구들에서처럼 실시간 센서들이 제어에 이용되기는 했지만, 열안정성, 신빙성 등 여러 가지 면에서 문제가 있다. 따라서, 측정하기 어려운 기질 농도 등의 중요 변수들을 다른 측정 변수로 추정하여 제어하는 방법들도 많이 연구되었다 (그림 3). Liu 등(1993)은 CER로부터 글루코즈 농도를 추정하였는데, B.flavum을 배양하여 L-lysine을 고농도로 생산하는 시스템에 이를 성공적으로 적용하였다. Wipf 등(1994)은 또 공기 도입속도, 배지 부피, CO2 농도를 측정하여 글루코즈 농도를 추정함으로써 대량의 □-interferon을 재조합 E.coli에서 생산하였다. Massimo 등(1991)은 페니실린 생산의 인공 신경망 모델을 이용하여 OUR 데이터로부터 비성장속도를 추정하였다.

그림 . 추정 변수를 이용한 기질 공급 방법.

앞에서 언급한 방법들은 특정 상태나 상태에 관계된 변수들을 측정하기 쉬운 변수들로부터 추정하고 이 변수를 원하는 값으로 제어하였다. 그 밖에도 여러 가지 방법이 있는데, Yamane 등(1992)은 지수 성장을 가정한 기질의 지수공급 방법의 모델 파라미터를 실시간으로 보정하여 배지 부피와 균체 탁도 측정치로부터 바로 기질 공급속도를 결정하는 방법을 E.coli HB101의 배양에 적용하였다. Turner 등(1994)은 재조합 E.coli JM107의 배양에서 비슷한 방법을 적용하였는데, HPLC로 갈락토즈와 아세트산 농도를 실시간 측정하여 성장 단계를 추정하고 마찬가지로 모델식의 파라미터를 보정하였다. Sakato와 Tanaka(1992)는 모델에서 얻어진 지수 공급식의 파라미터를 배출가스 분석치를 이용하여 보정하였다. Kim 등(1994)도 마찬가지 방법을 사용하여 poly (3-hydroxybutyrate)을 고농도로 생산할 수 있었다. 아주 최근에 Kurtz 등(1996)은 간단한 동적 모델과 비선형 관측기로 이루어진 비선형 제어를 개발하고 여러 가지 다른 제어 방식과 비교하였다.

또한, 최근에는 지식 기반 시스템인 퍼지와 인공 신경망이 생물 공정에도 많이 도입되고 있다. 1965년 Zadeh에 의해 제안된 퍼지(fuzzy) 이론은 비선형성이 크고 측정이 어려운 시스템의 모델링과 제어에 주로 적용되어 왔는데, 이는 제어 시스템에 전문가의 지식을 적용하고 안정된 제어 성능을 보증할 수 있기 때문이다 (그림 4).

Kitsuta와 Kishimot(1994)는 Brevibacterium종의 글루탐산 생산 제어를 연구하였는데, 탄소원의 공급과 페니실린의 첨가를 퍼지 감독자 제어 개념을 적용함으로서 배출가스중 CO2 성분을 PID로 제어할 때보다 균주성장 저해물질인 글루탐산의 생성을 더욱더 억제하였다. Nyttle과 chidambaram(1993)은 페니실린 농도를 실시간으로 측정할 수 있을 때 이를 이용하여 농도를 제어할 수 있는 퍼지 제어기를 설계하였다. Alfafara 등(1993)은 일반적인 퍼지제어기를 보정하여 생산성을 향상시키는 제어기를 제안하였다(그림 5). 이들의 제어기는 모델에서 가정을 통해 얻은 지수 공급 곡선을 퍼지 제어기로 보정하는 형식을 취하고 있다. Zhang등(1994)은 baker's yeast의 유가식 배양을 관찰하여 네가지 단계로 나누고 이 지식으로 RQ와 그 변화율을 입력으로하여 퍼지 제어기를 만들었다. 그밖에 퍼지 논리를 이용하여 발효 시스템을 모델링한 예도 많이 있는데, Jitsufuchi 등(1992)은 Z.mobilis의 자기성장 억제현상을 모델링하였고, Kishimoto등(1991)은 같은 시스템의 성장 phase를 모델링하였다. Terhi 등(1995)은 퍼지 시스템을 이용하여 yeast의 배양에서의 고장진단에 관하여 연구하였고 이는 발효 공정에서의 갑작스런 phase 변화에 대처할 수 있는 제어 시스템을 개발할 수 있었다. Fu 등(1990)은  acetyl spiramycin 발효 공정의 기질 도입 시점을 결정하는데에 퍼지 논리를 적용하였는데, 이차 대사물을 얻기 위한 제어 시스템으로서 좋은 성능을 보였다. 그리고 Whitnell 등(1993)이 상업적인 주조 시스템에 퍼지 이론을 적용하였다.

그림 . 퍼지 제어기의 구조 [Pedrycz, 1989].

그림 . 앞먹임-되먹임 (퍼지) 제어기의 구조 [Alfafara,1993].

퍼지 이론에 못지 않게 인공 신경망 또한 발효 시스템의 제어 및 모델링 분야에 빠르게 퍼지고 있다. Bo□kovi□과 Narendra(1995)는 선형, 비선형 제어기와 신경망 제어기를 유가식 발효에 각각 적용하였다. 이들은 baker's yeast의 유가식 발효에서 redox potential, 배기가스내 CO2 성분비, OD 등의 측정치로부터 균체와 글루코즈, 에탄올 등의 농도를 예측하는 성능을 비교하여 가장 좋은 성능을 보인 recurrent 신경망 제어기를 제안하였다. 최근에 Tholudur과 Ramirez(1996)는 유가식 발효의 최적화에 신경망을 도입했는데, 물질 및 에너지 수지에 신경망 모델을 엮어 모델의 정확도를 높였다. Teissier 등(1996)은 신경망 모델을 이용하여 yeast의 농도와 최종 균체농도를 정확하게 추정하였다. 그밖에 Latrille 등(1994)은 S.thermophilus ST23의 발효에 pH를 추정하는 모델을 recurrent 신경망으로 만들었고, Karim과 Rivera(1992)가 비슷한 방법을 Z.mobilis의 발효에도 적용하였다. 그리고, 균체 농도와 재조합 단백질 농도 등을 실시간으로 추정 혹은 예측하기 위한 시스템도 신경망 모델을 이용하여 개발되었다 [Glassey et al.,1994;van Breusegem et al.,1991].

퍼지 제어는 IF-THEN rule을 만드는데 많은 노력을 필요로 하며, 이를 보완하기 위하여 퍼지 논리와 신경망을 합성 또는 병행하기도 한다. Ye 등(1994)은 모델로부터 구한 지수 도입 곡선을 실시간을 보정하기 위한 알고리듬으로 FNN(fuzzy neural network)을 도입하였다. 이들은 변수간의 관계를 신경망으로 표현하고, 기질 공급 속도의 보정식은 퍼지 논리를 이용하여 구성함으로써 균체를 고농도로 배양할 수 있었다. Shi와 Shimizu(1992)도 신경망과 퍼지 개념을 병행하여 사용하였는데, DO와 에탄올 농도 측정치에서 퍼지 논리로 기질 도입속도를 결정하고, 발효 phase 변화에 따른 DO와 에탄올 농도 변화형태를 신경망으로 인지하여 도입속도식을 보정하였다. 또다른 그룹인 Zhang 등(1992)은 B.thuringiensis의 발효에서 두 개의 신경망 추정기로 OD를 실시간 예측하여 제어하였다.

결론

이 논문에서는 유가식 발효의 제어에 대한 최근의 여러 가지 연구들을 요약하였다. 이러한 시스템의 제어 목적은 과다 혹은 과소 공급을 피하기 위한 적절한 기질 공급 속도를 유지하는 것을 주 목적으로 한다. 간단한 지수 공급 전략과 여러 가지 변형들을 간략하게 정리하였다. 최근에는 퍼지 논리나 인공 신경망 이론과 같은 지식 기반 시스템들이 관심을 끌면서 많은 연구들이 시작되고 있다.

감사의 말

본 연구는 포항공과대학의 자동화 연구 센터와 한국 과학재단으로부터 부분적인 재정지원을 받아 이루어졌으므로 이에 감사드립니다.