P. chrysosporium에 의한 lignin peroxidase의 생성과 PCP의 분해

최 수 형 ·송 은·구 만 복·문 승 현

광주과학기술원 환경공학과

A study on synthesis of lignin peroxidase and degradation of PCP

by P. chrysosporium

Sue Hyung Choi·Eun Song·Man Bock Gu·Seung-Hyun Moon

Dept. of Environ. Sci. & Eng., KJIST, Kwangju, Korea

서  론

Lignin peroxidase는 기존의 화학적 처리공정을 대체하여 lignin을 분해할 수 있는 효소로서, cellulose를 이용한 전 처리 공정에 효율적으로 이용될 수 있다. 또한 이 효소는 임산자원의 생물공학적 활용 외에도 제지공업, 난분해성 물질의 분해를 위한 환경공정 등에 다양한 용도를 가지고 있다. 그러나 lignin peroxidase는 그 중요성과 잠재력에도 불구하고 대량생산이 이루어지지 않아 공업적인 활용이 지연되고 있다. lignin peroxidase는 호기성 곰팡이인 P.chrysosporium (white rot fungi)에 의해 생산될 수 있음이 잘 알려져 있는데, 높은 전단력에서는 효소의 생성과 활성이 저하되기 때문에, 통상적으로 이용되는 sparger 대신 낮은 전단력에서 빠른 속도로 산소를 전달할 수 있는 생물반응기가 필요하다. 본 연구의 목적은 P.chrysosporium을 이용한 고생산성 lignin peroxidase를 제조하는 배양조건과 생물반응기를 개발하는데 있다.

실험방법

균주 및 배지조성

본 연구에서는 P.chrysosporium(ATCC 24725)을 lignin peroxidase생산을 위한 균주로 사용하였다. 기본배지조성은 Methods In Enzymology, 161(1988)238에 따른다. 질소제한배지의 경우 10 g/L의 glucose, 0.2 g/L ammonium tartrate를 각각의 탄소원과 질소원으로 공급하였으며, 질소-탄소 제한배지에서는 2 g/L의 glucose, 0.2 g/L ammonium tartarate, 그리고 균농도를 높이기 위한 영양풍부배지에서는 glucose 10 g/L, ammonium tartrate 1.2 g/L, 0.5 % yeast extract를 각각 사용하였다. 균주는 39℃ 배양기에서 배양하였다. 효소의 활성도는  H2O2의 존재 하에 veratryl alcohol이 aldehyde로 전환시키는 초기속도를 측정함으로서 알 수 있다[1]. (310 nm에서 veratryl aldehyde의 몰흡광계수 : 9300 M-1cm-1)

Flask 배양에서 lignin peroxidase에 의한 PCP의 분해

2개의 500 mL의 영양풍부배지를 준비한 후 1.25X107 개의 포자를 접종하여 39 ℃ 배양기에서 30 일 동안 정체상태로 키운다. 이때 대기중의 공기만이 산소의 공급원이 되도록 하였다. 30일이 지난 후 한 개의 플라스크는 PCP(20 ppm)를 함유한 질소제한배지로 교체하였으며, 나머지 플라스크는 기존배지에 PCP(20 ppm)를 바로 첨가하였다. 시료 3 mL을  필터(0.22 □m)로 거른 후 핵산 3mL과 1 M Hcl 0.1 mL 을 첨가하고 교반한 후 PCP를 추출하였다. 추출된 PCP는 GC/ECD(HP 5890 series II plus)로 분석하였다.

Hollow fiber배양에서 lignin peroxidase에 의한 PCP분해

MWCO 5,000의 hollow fiber에 포자를 포함한 potato 배지(potato dextrose broth + yeast extract 0.5 %)를 주입하고 정체 상태에서 10 일간 균을 성장시킨 후 PCP를 함유한 질소결핍배지(glucose 10 g/L, ammonium tartrate 0 g/L)로 교체하여 효소형성을 유도하고 PCP 분해도를 측정하고자 하였다. PCP를 포함한 질소제한배지로 교체한 후에는 배지를 1 mL/min의 유속으로 순환시켜 주었다.  이후의 PCP의 추출 및 분석조건은 위에서 설명한 바와 같다. 본 실험에서 산소의 공급은 순수산소를 이용하여 12 시간 간격으로 1 시간동안 300 cc/min의 유속으로 실시하였다.

Polyurethane foam에 고정화 된 균주에 의한 lignin peroxidase의 생산           100 mL의 영양풍부배지에 가로 세로 높이가 각각 2 cm x 2 cm x 2 cm, 1 cm x 1 cm x 1 cm와 0.5 cm x 0.5 cm x 0.5 cm인 sponge(polyurethane, PUF)를 함께 멸균하여 준비하고 여기에 포자를 접종하고 교반식으로 배양하여 PUF 내부에 곰팡이가 고정화 되도록 하였다.  고정화된 균체는 SEM을 통해 확인하였다. 영양풍부배지에서 glucose가 다 소비되면 질소제한배지로 옮겨 lignin peroxidase의 형성을 유도하였다.

실험결과

질소제한 배지에서의 veratryl aldehyde 형성으로 측정한 효소의 생성

본 실험에서는 veratryl alcohol로부터 효소에 의해서 전환되는 veratryl aldehyde의 양을 측정함으로 배지 내에서 효소가 생성됨을 확인하였다. 질소제한배지에 1.9 X 109 spores/L를 접종한 후 기질로부터 전환되어지는 생성물의 양을 측정하였다. 그 결과  배양 10일까지 큰 변화를 보이지 않다가 15 일에서 26 일 사이에 급격한 veratryl aldehyde의 형성이 나타났으며, 이는 효소생성에 기인한 것으로 보인다.  이는  T. K. Kirk[2]가 대기중의 산소만을 이용하여 곰팡이를  배양했을 때 나타난 lignin 분해양상과 비슷하다.

이 조건에서는 효소생성량이 미비하여 veratryl alcohol 초기산화속도에 의해서는 효소를 정량 할 수 없었다.

고농도 균주와 고산소 조건에서의 lignin peroxidase의 생산

본 실험에서는 충분한 산소를 공급하기 위해서 Kirk. T. K 등[2]이 제안한 산소전달장치를 도입하여 실험하였다. 동결 건조된 ATCC 24725를 500 mL flask 100 mL의 영양풍부배지에 접종하여 120 rpm에서 배지내의 glucose 농도가 5 g/L가 될 때까지 배양한 후 질소-탄소 제한배지로 전환하여 효소생성을 유도하였다. 그 결과 배지전환 후 11 일 째에 2 U/L의 효소생성을 보이다가 24 일째에 10 U/L, 27일째에 30 U/L로 최대활성을 나타내었다. 30 일째부터는 다시 15 U/L의 활성도를 보이다가 점차 감소하였다. 따라서 균의 농도 증가와 산소공급이 lignin peroxidase 생산을 향상시킨 것으로 보인다.

Flask 배양에서 lignin peroxidase의 PCP 분해

영양풍부배지에서 균을 30 일 동안 성장시킨 후 여기에 직접 PCP를 첨가하여 분해되게 한 경우(Fig. 3 (a))에는 PCP는 시간이 지남에 따라 감소하고 첫 번째 산물로 보이는 6.5 분대의 peak가 점점 증가하는 것으로 확인되었으며 궁극적으로 PCP 봉우리는 없어지고 6.5 분대의 peak만을 남겨 둔 상태에서 더 이상의 분해가 일어나지 않았다. 이에 비해 질소제한배지로 교체함과 동시에 PCP를 첨가한 경우의 PCP 분해 양상을 보면 6.7 분대의 PCP  peak는 전자와 같은 경향으로 감소하지만 첫 번째 산물로 보이는 6.5 분대의 peak는 배양시간이 경과함에 따라 점차 증가하다가 다시 감소하였다(Fig. 3 (b)). 전자의 경우 첨가한 PCP(20 ppm)는 모두 첫 번째 중간산물로 분해되어지고  그 이상의 반응은 일어나지 않는데 반하여 후자의 경우는 PCP가 첫 번째 산물로 전환되어감과 동시에 첫 번째 산물은 그 다음 물질로 분해되고 있음을 보여준다. 따라서 PCP를 보다 더 낮은 오염수준으로 분해하기 위해서는 후자의 경우가 더욱 효율적일 것으로 보인다.

Fig. 3 Time course of PCP degradation in flask culture

(a) Self-limited condition           (b) Induced condition

Hollow fiber 배양에서의 lignin peroxidase에 의한 PCP 분해

본 실험에서는 MWCO 5,000의 hollow fiber가 사용되었으며 영양풍부배지에서 자란 균주를 질소 결핍배지(glucose 10 g/L, ammonium tartrate 0 g/L)로 교체하여 효소의 생성과 PCP의 분해를 유도하였다. 그 결과 PCP는 3 일 안에 분해되었다. hollow fiber 배양을 통한 PCP의 분해는 flask에서 측정한 PCP 분해에 비해 매우 효율적인 것으로 보이며 이는 hollow fiber에서의 조건이 효소의 생성에 매우 적합하다는 것을 보여준다. 일반적으로 lignin peroxidase는 veratryl alcohol과 PCP가 동시에 존재할 경우 PCP를 먼저 산화한다[3]. 따라서 첨가된 PCP는 hollow fiber내의 균에 의해 3일 내에 분해되어지고 분해가 진행되는 동안 veratryl alcohol은 산화되지 않은 채 남아있게 된다.

Polyurethane foam(PUF)에 고정화 된 균주에 의한 lignin peroxidase의 생산     앞에서도 언급합 바와 같이 lignin peroxidase는 전단력에 의해 쉽게 불활성된다는 점을 착안하여 본 실험에서는 P. chrysosporium을 PUF에 고정화 하여 생산성을 향상시키고자 하였다. PUF에 고정화된 균주는 그렇지 않은 균주에 비해 빠른 성장을 보여주었으며 lignin peroxidase의 생산시기를 앞당길 수 있었다.(Data not shown). SEM의 관찰결과 Fig. 4에서 보는 바와 같이 이 균주는 PUF에 쉽게 고정화 됨을 확인하였다. PUF는 고농도의 PCP를 흡착하고 독성을 낮추어 세포로 하여금 안전하게 이용할 수 있는 환경을 제공해 주는 것으로 알려져 있어서[4] 독성물질 분해능력을 갖는  P. chrysosporium 에 있어서 효율적인 흡착제의 역할을 수행할 수 있을것으로 기대된다.

Fig. 4 Fungi in the sponge obserbed by SEM

참고문헌

1. M. Tien, and T. K. Kirk, Christopher  Bull. Steady-state and Transient-state Kinetic Studies on the oxidation of 3,4-Dimethoxybenzyl Alcohol Catalyzed by  the Ligninase of Phanerochaete chrysosporium Burds, J. Biol. Chem., 261, 1786-1693, 1986.

2. T. K. Kirk, E. Schultz, W. J. Connnors, L. F. Lorenz, J. G. Zeikus, Influence of Culture Parameters on Lignin Metabolism by Phenerocyte chrysosporium, Arch. Microbial., 117, 277-285, 1978

3. N. Chung, Mechanism for the oxidation of phenolic compounds by

lignin peroxidase from P. chrysosporium	, A ph.D dissertation, University of UTAH , 25-32, 1995.

4. Zhung-Chung Hu, R. A. Korus, W. E. Levinson, and R. L. Crawford. Adsorption and Biodegradation of Pentachlorophenol by Polyurethane immobilized Flavobacterium, Environ. Sci. Technol. 1994, 28, 491-496.