친화성 막을 이용한 단백질의 크로마토그래피적 분리

이광진, 염경호

충북대학교 공과대학 화학공학부

Chromatographic Separation of Proteins using Affinity Membranes

Kwang Jin Lee, Kyung Ho Youm

School of Chemical Engineering, Chungbuk National University

서론

최근 생물기술이 유전공학의 발전에 따라 급속히 성장되면서 의약품, 식·음료품 등 다양한 생물제품들의 생산이 증가되고 있다. 이러한 생물제품들의 기본 물질인 단백질, 효소, 아미노산, 핵산 등과 같은 물질의 생물기술에 의한 생산농도는 극단적으로 기질 g 당 10-8 g 정도로 낮을 뿐만 아니라 분리정제의 후류공정이 전체 생산비용의 60% 이상을 차지하기 때문에 이들의 효율적인 분리정제법 확립이 절실히 요구되고 있다[1-4,10].

일반적으로 친화성 컬럼 크로마토그래피 기술은 단백질류 등이 포함된 혼합물에서 생체물질을 효과적으로 분리정제하는 기술로서 널리 사용되고는 있으나, 충진된 입자의 압축, 막힘(plugging)/오염(fouling), 특히 미세입자의 충진에 따른 높은 압력강하와 이에 따른 낮은 생산성의 문제점을 갖고 있다. 이러한 문제점을 개선하기 위한 시도로서 최근 기존의 칼럼 크로마토그래피 대신 친화성 막을 이용하는 생체물질의 분리정제법이 연구되고 있다. 친화성 막은 큰 유속과 낮은 압력강하 그리고 단위시간당 높은 생산성을 제공할 수 있다는 장점이 있으나, 생물제품에 대한 낮은 친화성의 단점도 갖고 있다[1].

친화성 분리조작에서 물질 분리능은 근본적으로 단백질 등과 같은 생체물질들의 리간드(ligand)에의 가역적 흡·탈착능에 좌우되며, 이에 영향을 미치는 주요인자로는 pH 및 온도와 같은 용액의 물리/화학적 조건과 유속, 머무름 시간, 리간드의 종류와 흡착능 등을 들 수 있으며, 이러한 인자들의 영향은 흡착거동과 탈착단계인 용출(elution) 과정을 통해 확인할 수 있다[8].

일반적으로 친화성 막의 제조는 소수성 막 표면에 친수성 피막을 형성시킨 다음, 여기에 단백질 등의 생체물질을 강하게 결합시킬 수 있는 group-specific 리간드들(예, antibodies, metal chelates, reactive dyes 등)을 결합시켜 제조한다[1,2,4,6,9].

본 연구에서는 polysulfone 막에 키틴이 탈아세틸화된 키토산[poly(2-amino-2- deoxy-D-glucose]을 도포시켜 친수성 피막을 형성시킨 후, 단백질에 대한 친화력이 우수한 reactive dye의 한 종류인 Cibacron Blue 3GA를 키토산 피막에 결합시켜 친화성 막을 제조하였다. 키토산은 피막형성 용이하며, -OH와 -NH2 기를 다량 갖고 있어 친수성이 강하여 dye의 -Cl 기와 쉽게 결합하여 키토산-dye 친화성 막의 제조가 용이하다. 제조된 친화성 막의 특성과 단백질 분리능을 친화성 크로마토그래피 기법으로 단백질의 분리 실험을 행하여 검토하였다[5].

실험

지지체 막으로는 Millipore사의 분획분자량이 300,000 달톤인 PTMK polysu- lfone 한외여과막을 사용하였으며, 이 지지체 막 표면에의 키토산-Cibacron Blue 3GA 친화성 피막의 형성절차를 Table 1에 나타내었다. 피막 형성시 키토산의 농도에 따른 Cibacron Blue 3GA의 결합량을 조사하여 최적 피막형성을 위한 키토산 농도를 결정하였다[7]. 제조된 친화성 막을 Fig. 1에 나타낸 바와 같이 유효 막면적이 11 cm2, 유로의 높이가 2.26 mm가 되는 평판형 모듈에 장착하고, 이를 통상의 HPLC(Waters Co., Baseline 810)에 연결하여 단백질의 용출(elution) 및 전열(frontal) 크로마토그래피 실험을 수행하여 UV/VIS 검출기(Waters Co., M486)로 280 nm에서의 크로마토그램을 얻어 친화성 막의 단백질 결합능과 분리능을 검토하였다. 이때 단백질로는 등전점이 서로 다른 BSA(I.P = 4.8), Myoglobin(I.P = 7.0), Cytochrome-C(I.P = 10.0)의 3가지 종류를 사용하였으며, 이동상으로는 0.12 M universal buffer(acetic acid, boric acid, phosphoric acid 각 0.04M)를 사용하였으며, 용액의 pH는 0.12 M NaOH로 조절하였다.

용출 크로마토그래피 실험은 시료의 농도 1 mg/ml, 주입량은 10 □l로 하여 이동상 유량을 0.2 ml/min에서 3 ml/min로 변화시켜면서 분리대상 단백질의 종류에 따라 적당한 pH에서 injection하여 단백질의 등전점인 I.P.에서 0.2 M KCl을 포함하는 buffer로 용출시켜 용출 크로마토그램을 얻었다.

전열 크로마토그래피 실험은 이동상 유량 0.5 ml/min에서 단백질의 농도를 0.2 mg/ml에서  3 mg/ml로 변화시키면서 용출 크로마토그래피 실험과 같은 조건의

Table 1. Preparation of chitosan-Cibacron Blue 3GA affinity membrane

CHITOSAN
Dissolution in dilute acetic acid (formation of chitosan/acid salt)
Solution: 1% acetic acid + 2.8% NaCl
Coating chitosan salt solution on polysulfone membrane
Drying
Evaporation: 2 hr, 60 ℃
Alkaline treatment (regeneration of chitosan)
3 % NaOH solution, 12 hr
Washing
Copuling with Cibacron Blue 3GA
1 % Cibacron Blue 3GA solution: 20 ml, 60 ℃, 1 hr Add NaCl 1.2 g, 2 hr Add NaCO3 0.4 g 80 ℃, pH 8 → pH 10, 2 hr
Washing
CHITOSAN-CIBACRON BLUE 3GA AFFINITY MEMBRANE

Fig. 1. Setup of chromatography experimental system.

buffer를 이동상으로 사용하여 전열 크로마토그램을 얻었다. 실험시 이동상중의 염의 농도, 이동상 유량, 단백질 주입량의 변화에 따른 친화성 막의 분리능과 dynamic mode와 static mode에서의 최대 분리가능한 단백질 결합량을 구하였다.

결과

Polysulfone 막의 표면에의 키토산 피막의 형성시 키토산 용액의 농도에 따른 Cibacron Blue 3GA의 결합량을 실험한 결과 피막 형성시 최적의 키토산 농도는 1 g chitosan/100ml이었다. 친화성 막에 의한 단백질의 크로마토그래피적 분리시 이동상 buffer에의 염 첨가에 따른 단백질 용출 정도는 KCl > NaCl > NaSCN > 순수 buffer 순으로 분리능이 높았다. 대표적인 용출 및 전열 크로마토그램의 결과를 Fig. 2에 나타내었다. 용출 크로마토그래피 실험 결과 염(KCl)의 농도가

(Ⅰ)                              (Ⅱ)

Fig. 2. Elution chromatogram(Ⅰ) and frontal chromatogram(Ⅱ) using

chitosan-Cibacron Blue 3GA affinity membranes.

0.5 M일 경우에 최적의 분리능을 나타내었으며, 이동상의 유량이 증가할수록 분리능이 감소하였다. 또한 혼합 단백질의 용출 크로마토그래피 실험 결과 각각의 단백질을 성공적으로 분리할 수 있었으며, 재현성 또한 우수함을 확인하였다. Fig. 2(II)의 전열 그로마토그램에서 A점는 loading stage, B점은 washing stage, C점은 buffer의 pH를 변화시킨 시점이며, D점은 elution stage이다. 실험 결과 이동상 유량이 증가할수록 단백질에 대한 binding capacity가 점차 감소함을 확인하였다.

참고문헌

1) X. Zeng and E. Ruckenstein, Supported chitosan-dye affinity membranes

and their protein adsorption, J. Membrane Sci., 117, 271(1996)

2) H.C. Liu and J.R. Fried, Breakthrough of lysozyme through an affinity

membrane of cellulose-Cibacron Blue 3GA, AIChE J., 40, 40(1994)

3) X. Feng and R.Y.M. Huang, Pervaporation with chitosan membrane. I.

Separation of water from ethylene glycol by a chitosan/polysulfone

composite membrane, J. Membrane Sci., 116, 67(1996)

4) B. Champluvier and M.-R. Kula, Dye-ligand membrane as selective

adsorbents for rapid purification of enzymes: A case study, Biotech.

Bioeng., 40, 33(1992)

5) N. Kubota, S. Miura, K. Saito, K. Sugita, K. Watanabe and T. Sugo,

Comprison of protein adsorption by anion-exchange interaction onto

porous hollow-fiber membrane and gel bead-packed bed, J. Membrane

Sci., 117, 135(1995)

6) E. Klein, E. Eichholz and D.H. Yeager, Affinity membranes prepared from

hydrophilic coatings on microporous polysulfone hollow fibers, J.

Membrane Sci., 90, 69(1994)

7) G.K. Chambers, Determination of Cibacron Blue F3GA substitution in Blue

Sephadex and Blue Dextran-Sepharose, Anal. Biochem., 83, 551(1977)

8) J.F. Kennedy and J.M.S. Cabkai, "Recovery Processes for Biological

Materials", John wiley & Sons Inc., pp. 393-400(1993)

9) S. Brandt, R.A. Goffe, S.B. Kesser, J.L. O'Connor and S.E. Zale,

Membrane-based affinity technology for commercial scale purifications,

Bio/Technology, 6, 779(1988)

10) H. Ding, M.-C. Yang, D. Schisla and E.L. Cussler, Hollow-fiber liquid

chromatogrphay, AIChE J., 35, 814(1989)