박테리오로돕신을 이용한 photoreceptor의 개발

민 준홍, 정 정원, 최 현구, 최 정우, 이 원홍

서강대학교 화학공학과

Development of a photoreceptor using Bacteriorhodopsin

J. Min, J.-w. Jung, H. G. Choi, J.-W. Choi, and W. H. Lee

Department of Chemical Engineering, Sogang University

서론

박테리오로돕신은 호염성(Halophilic) 박테리아인 Halobacterium halobium의 purple membrane에 존재하는 유일한 단백질로써, 산소가 부족한 경우에 태양광중에서 가시광선을 이용하여 수소이온을 세포 밖으로 배출함으로써 ATP를 생성할 수 있는 환경을 제공하는 기능을 가지고 있다[1]. 이러한 기능을 가지고 있는 단백질을 이용한 photoreceptor는 무기물로 제작되어진 기존의 반도체 photoreceptor보다 박막 제작방법이 간단하고, 단일 단백질분자 수준에서의 소자화가 가능하다는 장점이 있다.

박테리오로돕신을 사용하여 photoreceptor 분자소자를 개발하기 위해서는 단백질의 분자배열과 단백질이 가지고 있는 N-terminus와 C-terminus의 방향이 실제 박테리아 멤브레인의 구조와 유사한 박막을 제작하는 것이 중요하다. 이를 위하여 centrifugation, hydrophobic interaction에 의한 Langmuir-Blodgett 기법, magnetic field 등 여러 가지 원리를 이용한 박막 제작 방법이 개발되고 있으나, 이러한 방법으로 박막을 제작할 경우에는 순수 단백질을 이용할 수 없고, 사용되어 지는 유기 용매에 의해 박테리오로돕신의 구조가 파괴되어 activity가 감소하며, 박막화 효율이 감소하는 등 여러 가지의 단점이 있다.

본 연구에서는 박테리오로돕신이 가지고 있는 전기장에 대한 안정성과 bipolar properties를 이용한 Electrophoretic sedimentation method[2]를 사용하여 단백질 박막화를 수행하였다. 최적의 광전류 응답 특성을 얻기 위하여 가해주는 전기장의 세기 및 시간 등의 공정 변수를 고려하여 단백질 박막을 제작하였고, 제작된 박테리오로돕신 단백질 박막을 이용하여 광의 세기와 파장에 따른 광전류의 크기를 조사하였다.

이론

전기적 침강법의 원리

Purple membrane내에서 phospholipid(phosphatidylglycerol phosphate, 50-55%: glycolipid sulfate, 35-40%: phosphatidylglycerol sulfate, 8-10% including a very small amount of phosphatidylglycerol)에 둘러싸여 있는 박테리오로돕신은 248개의 amino acid로 이루어진 7개의 helix와 retinal chromophore로 구성되며, helix들 사이에서 retinal분자는 216번째 lysine amino acid와 schiff base linkage를 이루고 있다.[3]

박테리오로돕신에 광이 입력되어지면 retinal은 trans상태에서 cis상태로 isomerization이 일어나고, 이로 인해 schiff base의 nitrogen 원자에 결합되어 있는 수소이온이 이탈되어 세포외부로 이동하고, 세포 안의 수소이온이 다시 nitrogen으로 이동하여 결합하면서 안정된 trans형태로 변화하게 된다. 이러한 mechanism을 거쳐 박테리아 세포의 purple membrane에 수소이온의 구배가 생겨난다.

중성의 pH에서 박테리오로돕신의 전하분포는 세포내부의 cytoplasmic side가 extracellular side보다 상대적으로 음전하를 띠므로, 전기장 하에서 cytoplasmic side가 양극을 향하게 된다. 그러므로 electrolyte gel이 아닌 현탁액(suspended solution)하에서는 수십초내에 양극의 표면으로 침강하게 된다. 이러한 원리를 이용하여 electrophoretic sedimentation method를 이용하여 단백질 방향이 일정한 박막을 제작할 수 있다.

실험

물질

지질이 포함되지 않은 박테리오로돕신은 Sigma Chemical Co.(U.S.A.)에서 구입하였고, 광전류를 측정하기 위하여 사용된 측정장치로는 KEITHLEY236을 사용하였으며, 광원으로는 Xenon Lamp (Oriel, U.S.A.)을 사용하였다.

박테리오로돕신의 박막 소자 제작

Pt음극을 상부에 두고 polyacetate ring을 이용하여 ITO양극(200-500□)과 음극사이를 5mm정도 간격을 두어 고정한 후, 전극사이에 박테리오로돕신 (10mg of protein / mL of deionized water)을 주사기를 이용하여 삽입한다. 전압을 양단에 걸어준 후(10-15V), 박테리오로돕신이 침강하는 것을 확인한다. 침강이 어느 정도 이루어지면 전압이 가해진 상태에서 음극부근의 상부 용액을 걷어낸다. 얻어진 박테리오로돕신 박막을 적정 조건(room temperature, R.H. = 50-60%)하에서 24시간 건조시키고, 건조된 박테리오로돕신 박막의 상부에 상부전극으로 사용될 알루미늄을 증착시킨다.

결과 및 토론

전기적 침강법의 검증

Electrophoretic sedimentation method가 박테리오로돕신의 구조에 미치는 영향을 그림1에 나타내었다. 최대흡광도를 나타내는 파장이 변하지 않고 흡광영역이 일치하는 것으로부터 박막 제작을 위해 가해주는 전기장이 박테리오로돕신의 구조에 영향이 미치지 않는 것을 알 수 있었다. 또한 electrophoretic sedimentation method를 이용하여 제작된 박막의 흡광도 크기가 상온 상압에서 전기장 없이 건조시킨 박막보다 크게 나타났으며, 이로부터 electrophoretic method를 사용할 경우 박테리오로돕신의 배향성과 밀도가 향상되는 것으로 사료된다.

pH의 영향

광조사시 박테리오로돕신은 수소이온의 방출과 그에 따른 박막내의 수소이온 구배를 나타내므로 박막 제작시 현탁액의 pH는 중요한 제작조건의 변수이다. 그림2는 pH에 따른 박테리오로돕신 현탁액의 흡광도 변화를 나타낸 것이다. 그림에서 보여지듯이 pH 7에서 흡광도의 최대 값이 나타나는 것으로 보아 최적의 활성을 갖는 pH는 7임을 알 수 있다.

전기장의 영향

그림3은 과도한 전기장을 가해주었을 때 나타나는 흡광도의 변화를 나타낸 것이다. 과도한 전기장이 가해졌을 경우 박테리오로돕신의 흡광도는 최대흡광도의 파장이 오른쪽으로 이동하는 것을 볼 수 있는데, 이는 과도한 전기장을 사용하게 되면 현탁액이 전기분해되어 양극표면 주변의 국부 pH가 변화되어 최대흡광도 파장대의 흡광도 값이 감소하기 때문인 것으로 사료된다[4].

박테리오로돕신의 전형적인 광응답현상

제작된 박테리오로돕신 박막을 사용하여 광조사시 나타나는 광전류의 전형적인 신호는 그림4와 같다. 광전류를 측정할 시 알루미늄으로 증착한 상부전극을 양극으로 사용하여 미세한 전압(80mV)을 가하였다. 광조사시 약 10nÅ의 광전류 펄스가 나타나고 광을 제거할 시 같은 크기를 지닌 전류의 펄스가 반대방향으로 나타남을 볼 수 있다. 이러한 박테리오로돕신의 광전류 특성은 광조사시 retinal chromophore의 photoisomerization에 의한 박테리오로돕신의 순간적인 구조변화(conformational change)에 기인한다[5]. 그러므로 박테리오로돕신의 광전류는 조사되어지는 광의 세기에 비례하는 것이 아니라 조사되어지는 광의 세기 변화에 비례한다고 볼 수 있다.

조사되는 파장에 따른 박테리오로돕신의 광전류 특성

그림5는 조사되는 광의 파장에 따른 박테리오로돕신의 광전류 특성을 나타낸 것이다. 그림에서 보여지듯이 조사되는 광의 파장에 따른 광전류의 크기는 박테리오로돕신의 흡광도와 일치함을 볼 수 있다. 즉, 박테리오로돕신의 광전류는 다른 영향 없이 흡수되는 광에너지에 기인함을 알 수 있다.

조사되는 광의 세기에 따른 박테리오로돕신의 광전류 특성

그림6은 조사되는 광의 세기 변화에 따른 박테리오로돕신의 광전류 크기를 나타낸 것이다. 광전류는 조사되는 광의 세기 변화에 직선적으로 비례함을 알 수 있었고, 본 연구에서 제작된 박테리오로돕신 박막이 녹색 광을 측정할 수 있는 photoreceptor의 기능을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.

참고문헌

1. Miyasaka, T., Koyama, K., and Itoh, I.: Science, 255, 342(1992).

2. Haronian, D. and Lewis, A.: Applied Optics, 30(5), 597(1991).

3. Tsuji, K. and Hess, B.: Ferroelectrics, 86, 147(1988).

4. Baribeau, J. and Boucher, F.: Biochimica et Biophysica Acta, 890, 275(1987).

5. Miyasaka, T. and Koyama, K.: Thin Solid Films, 210/211, 146(1992).

감사의 글

본 연구는 1995년도 한국과학재단 특정과제(과제번호 : 95-0102-02-01-3)에 의하여 연구되었음.