폴리우레탄폼 내에서의 쥐 간세포 구상체 형성 및 간기능 활성도 측정

이 두훈, 안 재일, 이 재석*, 최 윤소**, 이 윤신***, 박 정극

동국대 화학공학과, 광주과학기술원 신소재공학과*,

(주)동성화학 중앙연구소**, 서울대학교 의과대학 의공학연구소***

Formation of Spheroids of Adult Rat Hepatocytes in Polyurethane Foam

and Observation of It's Activities of Liver Specific Functions

Doo-Hoon Lee, Jae-Il Ahn, Jae-Suk Lee*,

Yoon-So Choi**, Yoon-Shin Lee***, Jung-Keug Park

Department of Chemical Engineering Dongguk University,

Department of Materials Science and Engineering

Kwangju Institute of Science and Technology (K-JIST)*,

Central Research Institute, Dong Sung Chemical Co., LTD**

Institute and Department of Biomedical Engineering College of Midiciene

Seoul National University***

서  론

급성 간부전 환자나 간이식 대기상태에 있는 환자에 이용하기 위한 체외 간 보조장치에 대한 연구가 최근 활발히 진행되고 있다(1, 2). 간은 신장과는 달리 투석막과 같은 장치로는 대체할 수 없기 때문에 주로 동물의 간세포를 이용하게 된다. 따라서 분리된 간세포를 높은 활성을 보유한 채로 장기간 유지시키는 연구가 인공간 개발에 필수적인 요소가 된다. 간세포를 구상체(Spheroid) 형태로 배양하면 단층의 형태로 배양하는 것 보다 간세포 기능이 높은 수준으로 장기간 유지되는데 이러한 간세포 구상체 형성을 위한 기질로서 폴리우레탄폼을 사용하기도 하였다(3). 본 연구에서는 간세포 구상체 형성을 위한 기질로서 폴리우레탄폼을 제조하였고 체외 간 보조장치로서의 개발 가능성을 알아보기 위하여 제조된 폼에 간세포를 접종하여 구상체의 형성을 확인하였으며, 암모니아 제거, 요소 및 알부민의 분비와 같은 간세포 구상체의 간기능 활성을 관찰하였다.

실험 재료 및 방법

폴리우레탄폼의 제조

분자량 2000의 폴리프로필렌 글리콜 1몰당 분자량 338의 액체 MDI(Diphenyl- methane diisocyanate) 2.31몰을 반응시켜 먼저 10%의 NCO잔기를 갖는 프리폴리머를 제조하였다. 반응은 70∼80℃를 유지하면서 액체 MDI에 폴리프로필렌 글리콜을 조금씩 첨가하면서 4시간 동안 질소분위기 하에서 진행하였다. 합성된 10% NCO-프리폴리머에 0.9, 1.5%의 실리콘계 계면활성제와 4.6∼9.4%의 물을 첨가하여 2000rpm의 교반속도로 3분간 교반시킨 후 30분 정도 방치하면 발포된다. 이렇게 제조된 폴리우레탄폼을 직경 35mm, 두께 1mm로 자르고, 3번의 PBS세척 후 가압 멸균하고 세포 배양 배지로 다시 한번 세척한 후 간세포 배양에 사용하였다.

쥐 간세포의 분리

간세포의 분리는 Seglen-method(4)에 기초를 두고 변형된 방법을 실행하는데, 이는 in situ 상태에서 2단계로 시행하는 collagenase perfusion 테크닉으로서 그 방법은 다음과 같다. 180-200g 정도 무게를 갖는 rat을 케타민(0.1 ml/rat 100g)과 럼푼(0.01ml/rat 100g)을 주사하여 마취시키고, 해부용 가위를 사용하여 쥐의 복부를 열어 간문맥(potal vein)을 찾아서 catheter를 삽입하고 결찰사로 고정시킨 후 1단계로, calcium-free HEPES 버퍼를 25 ml/min의 유속으로 10-15분 흐르게 하여 간을 충분히 세척한다. 2단계로는 0.05% 농도의 콜라젠 분해 효소를 넣은 동일 완충용액을 20 ml/min의 유속으로 10분 동안 흐르게 하여 간조직의 기질부분을 느슨하게 분해한다. 효소 처리가 끝난 간을 잘라내어 페트리디쉬에 옮긴 후 수술용 메스로 캡슐을 자르고 거즈와 나일론 매쉬에 거른 후 4회의 원심분리(500rpm 2분)로 간세포 만을 분리한다. 분리된 간세포를 Trypan blue dye exclusion 방법과 hemacytometer를 사용하여 세포 농도와 생존도를 측정하였다. 보통 2∼3×108개 정도의 세포가 얻어지며 80% 이상의 생존도를 갖는다.

간세포 구상체 배양

배양 배지로는 William's E Medium에 Epidermal growth factor(20□g/l), Insulin(10mg/l), CuSO4·5H2O(0.1□M), ZnSO4·7H2O(50pM), H2SeO3(3	□g/l), Linoleic acid(50mg/l), NaHCO3(1.05g/l), HEPES(1.19g/l), Penicillin(0.0588g/l), Streptomycin(0.100g/l)을 첨가하여 사용하였다. 폴리우레탄폼(직경 35mm, 두께 1mm)은 6-well plate(Nunc. Co)에 배지로 세척후 미리 넣어 놓았으며 well 당 1×106개의 세포를 접종하였으며 배지는 well 당 3.3mL를 넣어 주었고 2mL의 배지를 접종 8시간, 24시간 경과후에 교체하였으며 그 후로는 매일 교체하였다. 간세포 구상체의 형성은 inverted microscope로 확인하였다.

간세포 구상체의 간기능 활성도 측정

배양된 간세포 구상체의 detoxification능력을 조사하기 위하여 암모니아의 분해속도를 아산제약의 indophenol kits를 사용해서 측정하였고 이에 따른 urea 생성농도는 Blood urea nitrogen assay kit(Sigma Co.)를 사용하여 측정하였다. 암모니아의 제거 속도를 측정하기 위하여 배양 4일째 부터 1mM NH4Cl을 첨가한 배지를 사용하였다. 간세포의 중요한 대사기능의 하나인 알부민의 합성 및 분비는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 법을 사용하였는데, 1차항체(IgG fraction to rat albumin), 알부민 표준, 2차항체(Peroxidase-Conjugated IgG fraction to rat albumin)는 OGARNON TECHNIKA CORPORATION 시약을 사용하였으며, 1차항체는 2□/□를 2차항체는 1/5000을 사용하였다.

결과 및 토론

폴리우레탄폼 제조 및 간세포 구상체 형성

10% NCO- 프리폴리머에 물 4.6∼9.4%, 계면활성제 0.9, 1.5%를 혼합하여 폴리우레탄폼을 제조하였으며 현미경 관찰 결과 pore의 크기가 300∼700□ 정도로 나타났다. Fig.1에 보이는 것과 같이 폴리우레탄폼에 접종된 간세포는 하루가 지나면 엉기기 시작하였으며 3일 후에는 거의 모든 세포가 80∼110□ 크기의 구상체를 형성하였다. Trypan blue dye exclusion 방법으로 폴리우레탄폼을 염색하여 관찰한 결과 대부분의 간세포 구상체가 살아있는 것으로 나타났다.

보다 빠른 간세포 구상체 형성을 위해서는 폴리우레탄폼의 porosity 증가나 foam의 cell type 최적화, 적절한 표면 개질 등의 개선이 필요한 것으로 생각된다.

간기능 활성도 측정

Fig.2는 암모니아의 제거 속도와 요소 분비 속도를 나타낸 것이다. 1mM의 NH4Cl이 포함된 배지는 구상체가 형성된 후인 4일 경과 후에 첨가하기 시작하였다. 요소 분비속도가 4일째 부터 급격히 증가하는 이유는 이것에 기인하는 것으로 보인다. 암모니아 제거 능력은 배양 11일이 지나면 거의 상실되는데 반하여 요소 분비는 배양 13일 지나도 계속되는데, 이것은 간세포 구상체가 배양 11일 지나면 외부에서 인위적으로 첨가된 암모니아 까지 제거할 능력은 상실되지만 세포 자체의 대사과정에서 발생하는 암모니아는 어느 정도 요소로 전환하는 것으로 생각된다.

Fig.3은 알부민의 분비 속도를 나타낸 것이다. 배양 시간이 흐를 수록 분비량은 감소하지만 상당 기간 동안 알부민이 분비되는 것을 알 수 있었다.

이상의 결과를 볼 때 폴리우레탄폼은 간세포 구상체 배양에 상당히 적합한 재료로 생각되며 체외 간 보조장치로의 개발 가능성을 가지고 있는 것으로 판단된다. 추후 연구는 간기능 활성도를 적어도 2∼3주 동안 초기의 높은 상태로 유지하기 위한 보다 개선된 폴리우레탄폼의 제조나 간세포 구상체 형성 조건의 최적화 노력이 더욱 필요한 것으로 판단된다.

참고문헌

1. Jacek Rozga, Achilles A. Demetriou, et.al.,"Isolated Hepatocytes in a

Bioartificial Liver: A Single Group View and Experience",

Biotechnology and Bioengineering, Vol. 43, 645-653, 1994.

2. Russel A.Shatford, Scott L. Nyberg, Wei-Shou Hu, et.al., "Hepatocytes

Function in a Hollow Fiber Bioreactor: A Potential Bioartificial Liver",

J. of Surgical Research, Vol 53, 549-557, 1992

3. H.Ijima, K.Funatsu, et.al.,"Application of Three Dimensional Culture

of Adult Rat Hepatocytes in PUF Pores for Artificial Liver Support

System", Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects, Vol 4.

81-86, 1992

4. Seglen P.O.,"Preparation of Isolated Rat Liver Cells", Meth. Cell.

Biol., Vol. 13, 29-83, 1975