지방질 생산 효모를 이용한 생물계면활성제의 생산

박 평규, 김 의용

서울시립대학교 화학공학과

Production of biosurfactant using oleaginous yeast

Pyoung Kyu Park, Eui Yong Kim

Dept. of Chemical Engineering, Seoul City University

서론

미생물이 생합성하는 생물계면활성제는 친수기와 소수기를 동시에 가지고 있는 양친매성 물질로서 물에 용해되어 물의 표면장력을 감소시킨다. 화학합성계면활성제는 과거에 주로 세제에 국한되어 이용되었으나 최근에는 각종분야에서 유화제, 분산제, 침투제, 습윤제등 여러 가지 용도로 사용되고 있다. 지난 10년 동안 미국 화학산업에서의 계면활성제 산업은 약 300% 증가하였으며 전 세계적으로 계면활성제의 수요는 연평균 2.3%의 증가를 보이고 있다. 또한 국내 생산량도 크게 증가하고 있는 추세이다. 생물계면활성제는 기존의 화학합성계면활성제의 독성과 난분해성으로 야기되는 환경문제를 해결할 수 있는 대체 계면활성제로서 생물체에 의해 생합성되는 물질이므로 생분해도가 높고 독성이 적으며 그  종류가 다양하여 세제, 식음료, 석유관련제품, 의약품, 화장품공업, 페인트공업 등에서 광범위하게 이용될 수 있으며 현재 기름에 오염된 탱크 슬러지의 처리, 전자기판의 3차 세척용으로 상품화되어 사용되고 있다. 최근의 한 연구에 따르면 AIDS 바이러스의 성장을 저해하는 특징이 있는 것으로 보고되어 부가가치가 높은 의약품으로도 활용될 전망이다.(1)

생물계면활성제의 응용개발분야로는 자원, 에너지 분리기술, 환경, 토목분야, 의학분야, 식품분야 등으로 그 영역이 확대되고 있으며 점차 전 세계적으로 환경문제가 심각해지고 있는 상황하에서 산업활동에 의한 환경오염이나 인체에  대한 유독성 등에 더욱 엄격한 제재가 가해질 전망이다. 따라서 생물계면활성제 기술개발의 산업화 및 성공여부는 환경적합성이 가미된 경제성에 있으며, 차세대 계면활성제로서의 가능성이 점차 증대되고 있다.

본 연구의 목적은 지질 합성능력이 우수한 효모인 Rhodotorula glutinis로 부터 생물계면활성제를 생산하기 위해 최적의 배양조건을 확립하고 생합성된 생물계면활성제의 물성을 검토하는데 있다.

재료 및 방법

사용균주 : Rhodotorula glutinis  K-501은 낙엽수에서 분리되어 한국생명과학연구소에서 동정되었다.

배지 및 배양조건 : 종균배지로는 YM 배지(glucose 10g/l, peptone 5g/l, yeast extract 3g/l, malt extract 3g/l) 를 사용하였고, 지질생산배지로는 Sucrose 6%; (NH4)2SO4 0.15%;  MgSO4 0.15%; KH2PO4 0.7%; Na2HPO4 0.2%; CaCl2 0.02%; yeast extract 0.05%를 기본배지로 하였으며, 탄소원과 질소원의 종류와 농도를 변화시키면서 사용하였다. 모든 실험은 30℃, pH 7.0 에서 6일간 진탕배양하였으며, 균체량은 660nm에서 흡광도를 측정하였다.

표면장력측정 : 추출된 생물계면활성제를 0.1M sodium acetate buffer(pH= 4.0 )에 녹여 De Nouy tensiometer(Yoshida Co.)로 측정하였다.

유화도 측정 : Cirigliano의 방법을 이용하였다. 시료 300□g를 0.1M sodium acetate buffer(pH=4.0)에 녹여 0.1ml의 hexadecane을 첨가하여 2분간 vortexing하여 유화시킨 다음 10분간 정치시킨 뒤 540nm에서 흡광도를 측정하였다.(2)

기포력 측정 : 100ml의 메스실린더에서 생성된 기포의 높이를 측정하였다.

분산력 측정 : 산화철과 계면활성제를 혼합한 후 660nm에서 흡광도를 측정하였다.

결과 및 토론

최적의 탄소원을 조사하기 위해 총 11종류의 탄소원을 이용하여  생합성된 세포외지질의 함량과 유화도를 측정하였다.(Table.1.) Lactose를 제외한 모든 탄소원이 미생물에 의해 소모되었으며 이에 따라 세포가 증식되었다. 세포외지질의 함량은 sucrose, fructose, glucose, cellobiose, mannose 등의 순으로 높게 나타났으며 단위세포당 세포외지질의 생합성 수율도 이와 유사한 순서로 나타났다.  또한 이들의 유화도를 측정한 결과 상용되고 있는 유화제인 Tween-80 보다 동일농도에서 약 2배 이상 유화능이 높은 것으로 조사되었다. 탄소원중에서도 특히 sucrose의 경우 세포외지질의 함량이 가장 높은 5.62g/l 의 값을 나타냈으며 수율 및 유화도에서도 우수한 결과를 나타내어 본 연구에서 최적의 탄소원으로 선택되었다.

질소원에 대한 실험결과(Table.2.), 일반적으로 유기질소원이 무기질소원보다 단위세포당 세포외지질의 생합성 수율이 높게 나타났으나 균체증식, 세포외지질의 함량 및 유화능은 무기질소원이 높은 것으로 나타났다. 무기 질소원의 경우 전체적으로 우수한 유화능을 보이고 있는데 이들중 (NH4)2SO4가 세포외지질의 함량이 가장 높았다. 무기질소원을 사용한 경우 유화도의 차이가 미미한 것으로 보아 이들로 부터 생합성되는 세포외지질의 조성은 유사한 것으로 판단되었다.

생합성된 지질의 농도변화에 따른 표면장력을 측정한 결과 세포외지질의 임계미셀농도(CMC)는 89 mg/l, 표면장력은 31 dyne/cm인 반면 세포내지질은 이보다 높은 임계농도값인 1000 mg/l, 36 dyne/cm로 나타났다. 세포내지질의 CMC 값은 비교적 높았으나 세포외지질의 CMC 값은 현재 계면활성제로 사용되고 있는 Cetylpyridinium chloride 의 값인 400에 비하여 상당히 낮을 뿐 아니라 표면장력도 낮아 계면활성제로서 우수한 특성을 가지고 있음을 알 수 있었다.(Fig.1.)

pH의 변화에 따른 계면활성제로서의 안정성을 검토한 결과 전 범위의 pH값에서 안정성을 유지하고 있음을 알 수 있었다.(Fig. 2)

세포외지질의 유화능을 측정한 결과(Fig. 3) 전 범위의 pH에서  변화가 거의 없었으며 화학적 계면활성제인 Tween 80과 Triton X-100보다 유화능이 약 2∼3배정도 뛰어난 것을 알 수 있었다. 따라서 본 균주가 생산하는 세포외지질은 유화제로서의 용도개발이 가능할 것으로 판단된다.

세포외지질의 기포형성력은 화학적 계면활성제인 Tween 80과 Triton X-100에 비해  매우 낮은 결과를 나타내었다.(Fig. 4)

Table.1. Effect of carbon source on the production of extracellular lipid(EL)

Carbon source	Dry cell weight(g/l)	EL(g/l)	Yp/x	Emulsifying activity
Glucose	12.66	3.55	28.04	0.62
Sucrose	12.77	5.62	44.00	0.76
Fructose	11.82	3.75	31.73	0.67
Mannose	12.56	2.48	19.75	0.76
Lactose	0.62	0.10	16.13	-
Srobitol	9.60	0.73	7.60	-
Mannitol	9.08	0.86	9.47	-
Galactose	11.99	0.32	2.67	-
Cellobiose	9.32	2.90	31.12	0.65
Xylose	7.99	0.22	2.75	-
Maltose	7.23	0.30	4.14	-

- : not detected

Table.2. Effect of nitogen source on the production of EL

Nitrogen source	Dry cell weight(g/l)	EL(g/l)	Yp/x	Emulsifying activity
NaNO3	12.01	4.41	36.72	0.60
NH4Cl	15.61	4.61	29.53	0.59
(NH4)2SO4	14.75	5.87	39.80	0.67
NH4NO3	16.49	4.00	24.26	0.62
Yeast extract	8.63	3.51	40.70	0.57
Malt extract	3.20	1.32	37.50	-
Peptone	6.60	3.58	54.24	0.36
Trytone	5.52	4.38	79.35	0.42
- : not detected

참 고 문 헌

1. Kosaric, N. "Biosurfactant" Macel Dekker, Inc. (1993)

2. Cirigiano, M., G. M. Carman. Applied. Environ. Microbiol. 50(4) 846-850

(1985)

3. Johnson, V., M. Singh., V. S. Yadav. Biotechnol. Lett.  14(6) 487-490

(1992)

4. Cooper, D. G.  Applied. Environ. Microbiol. 47(1) 173-176  (1984)