Pseudomonas fluorescene의 toluene 분해에 미치는 pH와 shaking의 영향

김경태, 김진욱, 김장규*, 김남기

성균관대학교 화학공학과, 현대중공업 마북리연구소*

The effect of pH and shaking rate in biodegradation of toluene

by Pseudomonas fluorescene

Kyoung-Tae Kim, Jin-Uook Kim, Jang-Kyu Kim*, Nam-Ki Kim

Department of Chemical Engineering, SungKyunKwan University

Mabookri Research Institute, Hyundai Heavy Industries Co., Ltd.*

서론

물질문명의 혜택아래서 인류는 폭발적인 인구의 증가와 함께 편리한 물질의 이로움을 누리며 살고 있다. 하지만 이로 인한 환경의 파괴는 인류의 생존과 자연의 존재를 위협하기에 충분했으며, 이를 막기 위한 인류의 노력은 많은 오염정화기술을 발전시켜왔다. 수많은 독성의 유기, 무기 화합물의 부적절한 매립, 처리, 투기 등으로 인한 이들 물질의 유출로 토양과 지하수 등이 오염되고 있다.

petroleum hydrocarbon성분인 BTEX(benzene, toluene, ethylbenzene, xylene)(1)과 그밖에 다양한 PAH(polyaromatic hydrocarbon), TCE(trichloroethylene)(2), PCB( polychlorinated biphenyl), PCP(pentachlorophenol)과 같은 성분과 중금속등과 같은 난분해성 물질(xenobiotics, recalcitrance)등이 그러한 물질들이며, 이중에서 toluene은 1988년 EPA조사결과 화학물질로 오염된 지역 근처에 Surface water의 28%, ground water의 54%안에서 toluene을 발견되었다.(3)  toluene에 의한 오염은 지하저장탱크에서의 gasoline의 leakage 가 주요한 원인이 된다.

20oC에서 물에 515mg/L의 용해도를 가지고 있어,(1,3) 환경기준에 비하여 상당한 양이 물에 용해가 가능하여 심각한 오염원으로 작용하고 있다.

이러한 toluene을 제거하기 위해서 이를 분해하는 기존의 미생물이나, 특수한 미생물을 이용하게 되는데 미생물의 성장 자체에 영향을 미치는 pH는 오염물질 제거효능에 밀접한 관련을 가지고 있다. 오염물의 생물학적 분해의 기본적원리는 오염물질을 분해시킬 수 있는 미생물이 잘자라는 환경을 조성해 줌으로써 오염물질을 분해하는 것이 일반적인 방법이다. 이 방법에 주로 영향을 미치는 인자는 오염물질의 양, 조성, 성질, 미생물의 특성, pH, 온도, 습도, 미량원소, 독성 등을 들수 있는데(4) 본 연구에서는 혐기상태에서 pH와 shaking속도의 변화에 따른 균주성장과 이에 따른 toluene의 분해정도를 알아보고 이후 Bioremediation 공정에서 toluene의 분해시 최적조건을 수립하는데 유용한 자료로 이용하고자 한다.

이론

Biodegradation and Bioremediation

1.  Biodegradation

미생물들은 유기성분들의 대사공정에 의한 분해를 통해서 에너지를 얻게 되고, 오염물질을 제거하게 된다. 효소를 가지고 있는 미생물은 화합물질들을 분해하는 능력을 가지고 있다. 호기일때는 O2를 electron acceptor로 사용하며 최종생성물은 CO2 H2O가 일반적이며, 혐기일때는 sulfate(SO4), nitrate(NO3)등이 사용될 수 있다. 혐기공정의 경우는 생성물로서 메탄(CH4), CO2가 생성된다.

2.  Bioremediation

오염지역을 원래의 상태로 복원하는 생물학적 처리기술의 총칭으로서 몇가지 오염물 제거를 위한 성분이나 조건을 첨가하여 자연적 소화용량내에서 오염물질들을 자연분해 하도록 유도하는 방식과 그이상 분해가 가능하도록 인위적인 처리 공정을 이용하는 방식등으로 크게 나눌수 있으며, 또한, 오염지에서 직접처리하는 in-situ처리 방식과 오염수나 오염토양등을 처리효울을 증대시킬수 있는 처리시설로 이동시켜 처리하는 ex-situ처리 방식으로 나눌수 있다.

Table 1.  오염토양의 생물학적 복원공정에서의 BTEX의 일반적반감기

Chemical	Half-life value (t1/2) (days)
Benzene Ethylbenzene Toluene o-Xylene m,p-Xylene	0.1-1.0 6.1 6.4 93.9 8.5-14.7

실험

사용균주 및 배지조성

KCTC(한국과학기술연구원 유전공학센터)에서 Pseudomonas fluorescene(KCTC 1767)을 분양받아 사용하였다.  액체배지는 beef extract 3g/L, peptone 5g/L, 1L증류수를 사용하였다.

배양조건

1L플라스크에 500ml의 액체배지를 만들고 pH를 조절한후 autoclave를 시킨후에 질소를 투입하여 anoxic생태를 만든후 100ppm의 toluene을 투입하여 균체를 성장시키며 5시간마다 sampling하여 균체의 성장과 pH의 변화 및 toluene의 분해상태를 측정하였다. 이와 같은 플라스크 실험으로 조건에 대한 기본 data를 얻고 토양반응기(지름:150mm, 높이:500mm)를 이용하여 토양에서의 균체성장 및 toluene의 제거를 실험하였다.

분석

pH는 pH meter(Orion 420A)를 사용하여 측정하였으며, 균체량의 측정은 UV spectrophotometer(Duksan OPTIZEN)를 이용하여 640nm에서 측정하였으며, 검량선을 작성후 sample의 흡광도값을 균체량으로 환산하였다. toluene량의 측정은 GC(HP 5890A)를 사용하였다. 검량선을 작성한후 시료를 0.5ml채취하여 o-dichlorobenzene으로 toluene을 추출하였다. 이것을 원심분리하여 층분리를 이룬후 o-dichlorobenzene층을 취하여 수분을 제거하고 GC에 injection하였다.

결과 및 토론

pH 5,6,7,8,9의 각각의 sample들이 시간이 지날수록 중성에 가까워지는 경향을 보였다. 정확한 원인은 모르겠으나 미생물의 toluene분해공정과 pH를 맞추기 위해 초기에 투입된 NaOH와 HCl이 함께 반응하여 상쇄되는 경향을 보이는 것이 아닌지 추측하고 있으나 정확한 원인은 현재사용중인 균주의 분해 mechanism을 명확히 모르는 상황에서 섣불리 결론을 내리기는 힘들 것 같다.

미생물의 성장과 shaking속도는 밀접한 관련이 있는 것은 이미 알고 있는 사실이다. 너무 느린경우와 너무 빠른 경우 균체의 성장이 감소하는 사실을 알수 있었다. toluene의 제거결과는 pH에 따라서 명확한 형태를 보이지는 못하지만 일반적으로 균체의 성장이 잘 이루어지는 pH 6,7,8부근에서 균체의 성장과 더불어 toluene의 분해또한 pH 5,9영역 보다는 더 나은 것으로 나타났다.

혐기공정을 통한 분해가 실제로 효율면에서는 호기보다 떨어지지만, 산소를 실제 처리공정에서 추가로 산소를 공급할 필요가 없다는 이점이 있는데, 이는 시설비면에서 호기공정에 비해 저렴하다는 것이다. pH의 경우 7정도의 중성이 균체의 성장에 적합하였으며, shaking속도는 60rpm, 180rpm, 120rpm순으로 성장이 좋았다. bioremediation의 ex-situ처리공정시 토양과 균체를 혼합하여 분해할 경우 적절한 회전수는 분해 조건에 중요한 factor로 작용할수 있을 것이다.

참고문헌

1.	Zeyer, J., Kuhn, E. P. and Schwarzenbach, R. P.,: Appl. Environ. Microbiol., 52, 944-947(1986)

2.	Wilson, J. T. and Wilson, B. H.: Appl. Environ. Microbiol., 49, 242-243

(1985)

3. Hutchins, S. R., Sewell, G. W., Kovacs, D. A. and Smith, G. A.: Environ. Sci. Technol., 25, 68-76(1991)

4. Baker, K. H. and Herson, D. S. "Bioremediation", McGraw-Hill, Inc(1994)

Fig1. the change of pH at 16oC, 180rpm       Fig2. the change of cell mass at 16oC, 180rpm

Fig 3. the change of toluene at 16oC, 180rpm