Steinernema carpocapsae로부터 공생박테리아의 분리 및 동정

유연수, 박선호

계명대학교 화학·재료공학부

Isolation and Identification of Bacterial Symbiont

from Steinernema carpocapsae

Yeon Su Yu, Sun Ho Park

School of Chemical Engineering and Materials Engineering,

Keimyung University, Taegu 704-701

서론

최근 화학농약을 대신할 수 있는 무공해방제법으로 관심이 집중되고 있는 생물학적 농약은 자연생태계에 존재하는 유용인자를 사용하기 때문에 환경에 대한 오염이나, 사람이나 가축 또는 야생동물에 대한 부작용이 없고, 천적류에 대한 해충의 저항성 문제도 최소화 할수 있는 장점이 있다.

Neoaplectana, Steinernema 그리고 Heterorhabditis속 곤충 병원성 선충은 측미선구강(Sececernentea)의 원충목(Rhabditida)에 속하며 장내에 공생박테리아를 보유하여 생물 살충제로 살포 시 해충의 유충에 침입한 후 해충의 혈강(hemolymph)에 이들을 분비함으로써 곤충 숙주를 사멸하는 것으로 알려져 있다(1-2). 이들중 특히 Enterobacteriaceace류에 속하는 Xenorhabdus는 그람음성균으로 간균(rod-shape)형태인데 혈강 내에서 유충 시체를 영양원으로 증식하여 life cycle의 정지상까지 성장하여 광역 항균 스펙트럼의 항생제를 포함한 몇가지 생성물을 분비하여 유충 사체 내에서의 다른 미생물의 증식을 억제하기도 한다(3).

본 연구에서는 국내에서 서식하고 있는 곤충병원성선충인 Steinernema carpocapsae 종의 살충효과를 규명하기 위하여 선충과 공생관계에 있는 박테리아를 분리하고 동정하였으며, 또한 이들이 해충에 미치는 독성을 조사하였다.

실험재료 및 방법

1. 공생박테리아의 분리 및 동정

Steinernema carpocapsae 선충은 국내에서 채집한 것(경상대학교 농생물학과 선충연구실)으로 공생박테리아의 분리를 위하여 다음의 세가지 방법을 사용하였다. 첫째, 0.5% NaClO 용액에 10분간 침지시켜 표면살균된 선충을 YS 배지가 첨가된 tube에 담아 vortex로 선충을 파괴시킨 후 28℃ shaking incubator에서 48시간 배양한 후 배양액을 Nutrient agar, MacConkey agar, 그리고 NBTA에 plate out하여 colony를 분리하였다. 둘째, 꿀벌부채명나방 유충의 hemolymph액을 Nutrient agar에 무균적으로 몇방울 떨어트린 다음 표면살균된 선충을 그 위에 미량 떨어트려 48시간 배양 후 선충이 hemolymph액에 분비한 공생박테리아에 의해 생성된 colony를 분리하였다. 셋째, 선충 접종 48시간 후 사멸한 꿀벌부채명나방 유충 사체를 무균적으로 해부한 후 사체 내부액을 plate out하여 colony를 분리하였다.

Steinernema carpocapsae 선충으로부터 Nutrient agar, MacConkey agar, 그리고 NBTA를 이용하여 순수분리한 colony를 BUGM배지에서 2회 배양하여 순수한 colony를 생성하였다. 생성된 colony는 0.85% saline에 풀어서 현탁액을 만들고 탁도가 적정 범위에 오도록 맞췄다. 적정량의 현탁액을 접종하고 24시간동안 배양한 microplate를 동정시스템에 입력하고 95개 carbon source 각각에 대한 산화능을 조사하였다. 또한 동정시스템에 내장된 566 종/속의 그람 음성균 data base software를 이용하여 동정 결과를 조사하였다.

2. 공생박테리아의 특성 및 병원성 조사

분리된 박테리아에 대한 특성을 확인하기 위해서 Nutrient agar와 MacConkey agar에서 성장여부 및 colony 색, 곤충병원성, 37℃ 성장 가능성, bromothymol blue 흡수능, morphology 특성등을 조사하였다(4).

분리된 박테리아의 곤충병원성을 조사하기 위해서 먼저 NBTA에서 성장한 균주의 colony를 멸균된 식염수(0.9% NaCl)에 현탁한 후 희석하여 균주의 농도를 달리하였다. 다른 농도의 균주 현탁액을 5□L의 microsyringe를 이용하여 꿀벌부채명나방의 아랫쪽 다리를 찔러서 혈강 내에 주입하였다. 또한 박테리아가 toxin을 체외로 분비하는가를 확인하기 위해서 YS배지에서 균주를 48시간 배양한 후 성장한 균주와 배양액을 함께 유충에 주입하였으며, 또한 균주배양액을 10,000rpm에서 15분간 원심분리하여 분리한 상등액을 유충에 주입하여 각각의 병원성을 비교하였다. 접종 균주농도는 접종 현탁액을 희석한 다음 plate out하여 확인하였으며, 접종한 꿀벌부채명 나방 유충을 25℃ incubator에 보관하면서 사멸시간을 조사하였다.

결과 및 토의

Steinernema carpocapsae 선충으로부터 Xenorhabdus를 분리하기 위한 세가지 방법 모두 동일하게 Xenorhabdus 균주가 분리되었다. 꿀벌부채명나방 유충에 선충을 접종하여 균주를 분리하는 방법에서는 수종의 유충내 다른 균주가 발견되었으나(5) 각각 Nutrient agar, MacConkey agar, 그리고 NBTA에서의 성장특성 차이를 이용하여 분리하였다. 또한 순수분리된 균주를 YS 배양액에서 in vitro배양한 결과 phase I과는 다른 특징을 가지는 phase II, 즉 동질이형(dimorphism)이 발견되었다.

Table 1은 Xenorhabdus의 phase I과 II의 성장 및 생리특성을 나타낸 것이다. Colony색을 보면 phase I과 II 모두 NA에서는 yellow인 반면, MacConkey agar에서는 phase I은 red-brown이고 phase II는 bright pink이었다. 또한 NBTA에서는 phase I은 blue 혹은 green을 보였으나 phase II는 red를 보였다. 그러나 이들 모두 분리된 균주의 morphology는 간균(rod)의 형태를 보였다(Fig.1).

분리된 균주의 phase I과 II를 내장된 566 종/속의 그람 음성균 data base를 이용하여 동정한 결과, phase I은 유사도(similarity) 0.543으로 Xenorhabdus nematophilus로 그리고 phase II는 유사도 0.833으로 Enterobacter cloacae A로 각각 동정되었다. 그러나 Xenorhabdus nematophilus종이 catalase에 대해 음성적인 특징을 보인 것은 일반적으로 Enterobacteriaceae와는 다른 결과를 보였다(6). 참고적으로 Steinernema glaseri로부터 분리한 공생박테리아의 경우 phase I은 유사도 0.834로 Xenorhabdus nematophilus로 그리고 phase II는 유사도 0.822로 Xenorhabdus nematophilus로 거의 비슷한 유사도로 동일한 동정결과를 보였다(7).

Fig. 2는 분리된 균주에 대하여 꿀벌부채명나방 유충에 대한 균주 접종농도를 달리하였을 때 유충사멸속도를 조사한 결과이다. 유충 1마리당 분리된 균주 각각의 접종농도는 0, 4, 60, 8600마리였는데 1마리당 접종농도가 0, 4마리인 경우는 유충이 사멸하지 않은 반면 60마리인 경우는 38시간 그리고 8600마리인 경우는 20시간만에 유충을 사멸하였다. 또한 박테리아가 toxin을 체외로 분비하는가를 확인하기위해서 박테리아를 YS배지에서 48시간 배양한 후 성장한 균주와 배양액을 함께 유충에 접종한 경우는 16시간만에 유충을 사멸하였으며, 원심분리에 의해서 분리한 상등액을 접종한 경우는 27시간만에 유충을 사멸하였다. 이때 균주배양액의 유충 1마리당 균주접종농도는 약 2x105마리였다. 또한 박테리아를 접종하지않은 YS배지를 접종한 경우는 유충을 사멸하지 못하였다. 결론적으로 박테리아는 체외로 꿀벌부채명나방 유충을 사멸하는 toxin을 분비하는 것으로 조사되었다.

감사

본 연구는 1997년도 한국과학재단  연구비(970-4020-201-3)지원으로 수행되었으며 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. Akhurst, R. J. and Boemare, M. E.: Entomopathogenic nematodes in

biological control, CRC Press, Florida, 75-92(1990).

2. Bird, A. F. and Akhurst. R. J.: Int. J. Parasitol. 13, 599-606(1983).

3. Akhurst, R. J.: Nematodes and the biological control of insect pests, CSIRO

Publication, Melbourne, Australia, 127-136(1993).

4. Boemare, N. E. and Akhurst, R. J.: J. Gen. Microbiol. 134, 751-761(1988).

5. Park, S. H. and Yu, Y. S.: Keimyung Univ. Bull, I.I.S. 21-1, 37-46(1998).

6. Boemare, N. E., Akhurst, R. J. and Mourant, R. G.: Int. J. Syst. Bacteriol.

43, 249-255(1993).

7. Park, S. H. and Yu, Y. S.: Biotechnol. Bioprocess Eng., submitted(1998).

Table 1. Characteristics of bacteria isolated from Steinernema carpocapsae.

Characteristics	XR-PC(I)	XR-PC(II)
Pigment	yellow	yellow
Bioluminescence	-	-
Insect pathogenicity	+	+
Growth on 37℃	-	-
Colony colour on MacConkey agar	red-brown	bright pink
Adsorption of bromothymol blue	+	-
Catalase	-	-
Lecithinase	+	+
Urease	-	-
Phosphatase	-	-
Lipolysis(tween 85)	+	+

Fig. 1. Scanning electron micrograph of bacteria isolated

from Steinernema carpocapsae.

Fig. 2. Pathogenicity of Xenorhabdus nematophilus against

Galleria mellonela larva.