Methylosinus trichosporium OB3b를 이용한

Chloroform과 Methylene Chloride의 분해

양 진 우, 장 덕 진

명지대학교 화학공학과

Degradation of Chloroform and Methylene Chloride

by Methylosinus trichosporium OB3b

Jinwoo Yang, Deokjin Jahng

Department of Chemical Engineering, Myongji University

서론

공업화의 진전에 따라 산업계 전반에 걸쳐 다량의 화학물질이  배출됨으로써 이에 수반된 환경오염 문제가 심각해지고 있음은 잘 알려진 사실이다. 특히 CF(chloroform), DCM(dichloromethane)등의 CAHs(Chlorinated Aliphatic Hydrocarbons)들은 그 자체로도 유해(toxic)하며, 발암성(carcinogenic)을 지니고 있어 이들 물질에 의한 환경오염은 세계적인 주목을 받고 있는데 특히 자연적으로 쉽게 분해되지 않는 특성과 저 농도에서도 심각한 문제를 야기 시키는 이유로 발생 원에서부터 최종처리 단계까지 엄격한 관리와 완벽한 처리가 요구된다. 이들의 처리에 90년대 이후 시도된 생물학적 방법은 처리비용에 비해 완전한 처리와 부 생성물이 없다는 장점으로 각광을 받고 있다. 이러한 처리 방법중 미생물의 공대사를 이용하는 방법이 있고, 본 연구에서는 Methylosinus trichosporium OB3b의 공대사를 이용하며, 발현된 sMMO(soluble methane monooxyganase)에 의해 CF와 DCM을 처리하게 된다. M. trichosporium OB3b는 TCE (trichloroethy- lene), CF를 비롯한 대부분의 지방족 염소화합물을 분해하는 것으로 알려져 있고,1,5) 넓은 분해기질 범위와 빠른 분해속도를 가진 장점으로 인하여 많은 연구의 대상이 되고 있다.3)  특히 가장 많이 연구된 TCE의 분해에 있어서 M. trichosporium OB3b는 낮은 성장속도와 구리에 의한 sMMO의 발현억제에도 불구하고, 타 균주에 비해서 10∼50배의 빠른 분해속도를 지니는 장점을 가지고 있다.4)

M. trichosporium OB3b는  CF와 DCM 분해에 적용할 수 있는데, CF는 분해하는 균주가 극히 한정되어 있고, 또한 이들은 한자리 미만의 극히 낮은 분해속도와 낮은 성장속도 등의 문제점을 가지고 있어 생물학적인 처리에 이들을 이용하기에는 어려운 점이 있는데 반해서 M. trichosporium OB3b는 타 균주와 비교했을 때 성장속도와 분해속도가 우월한 것으로 알려져 있어 CF의 분해를 위한 실용화 공정에 사용할 수 있는 가능성이 높은 것으로 사료된다.2)

본 연구에서는 회분식 플라스크 배양으로부터 습득한 휴지세포를 이용하여 여러농도 CF와 DCM을 다양한 균체 농도에서 분해속도를 측정하고, 이것을 기반으로 생물 반응기에서 연속배양을 통해서 얻은 배양액을 세척하지 않은 상태에서 분해속도를 알아보고자 하였다. 또한 배지 내에 녹아 있는 CH4이 CF와 DCM에 각각 어떻게 영향을 미치는 지, 그리고 CF와 DCM이 공존되어 있는 상태에서 각 물질의 분해속도가 어떻게 영향받는지 알아보고자 하였다.

실험방법

1. 사용균주 및 배양조건

M. trichosporium OB3b (ATCC. No. 13050)는 부산대 박성훈 교수님에게서 입수하였으며, 배양에는 nitrate mineral salts medium인 modified Higgin□s medium을 사용하였으며 플라스크 배양에시는 30℃, 200rpm 조건에서 회전 배양기(한국종합기기제작소 HK-S225C)를 이용하였으며, 공급되는 혼합 gas는 메탄  100 ml/min (99.97%, JC gas), 일반 air 400 ml/min (JC gas)를 flow meter(동양계기교역 DY-NP)를 사용하여 1 : 4 (v/v)의 비율로 혼합 사용하였다. 플라스크는 완전히 밀봉하였으며, 혼합 가스는 매 24시간마다 0.2□ pore size filter(whatman 50mm)를 통하여 공급하였다. 접종량은 배지 량의 5% (v/v)미만으로 하였다.

연속배양에서는 한국발효기 5L 용량에서 운전용량 2L로 하였으며, 사용배지는 modified Higgin□s medium을 사용하였는데 침전상의 이유로 1.2□ glasswool filter(Watman GF/C 110mm)를 사용하여 1차 여과 후 0.2□ capsule filter(Gelman sciencs)로 재차 여과하여 침전이 없는 무균상태 배지를 공급하였다. 30℃, 500rpm조건에서 혼합 gas는 메탄 200 ml/min (JC gas), 일반 air 1000 ml/min (Uromatic air compressure, Italy)을 flow meter(Dwyer RMA-11-SSV)를 사용하여 1 : 5 (V/V)로 공급하였다. 접종 seed는 연속적인 계대배양을 통해 활성이 유지된 것을 사용하였고, 배지량의 5%미만(100ml)으로 접종하여 초기 ABS600값이 0.06정도가 되도록 조절하였다. pH는 1N H2SO4와 1N NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조절하였다. 거품의 형성시에는 antifoam 10%(v/v)을 최소량 주입하였다. 배지의 공급은 reservoir(Nalgene carboy 25L)에서 silicon tube (Eyela ID:1.15 OD:3.2)를 통하여 peristaltic pump(Eyela SMP-23)로 80ml/hr (D = 0.04)속도로 공급을 하였다.

2. 분석조건

2.-1 세포농도의 측정

배양액의 세포농도의 측정은 분광광도계 (spectrophotometer, 영화과학 Smart Plus-3255)를 이용, 파장 600nm에서 흡광도 (OD, absorbance, A600)를 측정하였으며, ABS600의 값이 0.5를 초과할 때는 희석하여 측정하였다.

2.-2 CF 분해 속도 측정

a. Resting cell 제작

회분식 플라스크에서 성장된 배지를 대수증식기에서 획득하여 원심분리기 (UNION55R, 한일)를 이용하여 5000rpm, 12min에서 원심분리 후 상등 액을 버리고 인산완충용액 (pH 7.0)에 현탁시켰다. 반복하여 두 번 이상 세척한 후 실험에 사용하였다.

b. 분해속도 측정

사용된 용기는 43ml 갈색 vial로 흡착 및 휘발을 최대한 억제하기 위해 Teflon이 코팅된 septum이 장착된 뚜껑을 사용하였다. OD를 0.5∼2로 조절하여 vial에 5ml를 주입하고 여기에 CF와 DCM을 20∼80□M의 농도로 적절히 주입하였다.

연속배양으로 얻은 세포성장액을 5ml를 vial에 취하여 CF, DCM을 일정량 주입하였다. 분해반응은 회전 배양기에 30℃, 200rpm조건으로 수행하였으며, vial의 head space에서 10∼50□L의 sample을 채취하여 FID(flame ionized detector)와 ECD(electron capture detector)가 장착된 GC(gas chromatograph, Shimadzu GC-14B, Japan)를 이용하여 분석하였다. GC에 장착된 column은  capillary column(Altech AT-502.2, length: 30m, ID: 0.25mm, film thickness: 1.4□)을 사용하였다. Carrier gas로 N2 (JC gas, ultra zero grade)를 사용하였으며, 온도는 column 40∼100℃, injector 220℃, detector 250℃으로 조정하였다. 시료채취에는 gas-tight syringe (Hamilton U. S. A. 10∼50□L)를 사용하여 10∼50□L의 sample을 GC로 주입하였다.

실험결과

a. Batch test

Vial내 동일한 균체량의 경우 주입 농도가 높을수록 초기 분해속도가 빠르다는 것을 알 수 있었고 농도가 낮을수록 분해 종말시점이 짧았다.  DCM의 경우에도 같은 결론을 얻을 수 있었다. vial에 주입 CF, DCM농도를 일정하게 한 후 균체량을 다양하게 변화를 주어 분해속도를 측정한 경우 균체량(OD)의 증가가 초기분해 속도의 증가를 초래하지는 않았으며, 단지 분해종말 시점을 빠르게 할 수 있다는 것을 알 수 있었다. CF와 DCM이 복수로 존재 시에는 분해속도의 감소와 분해종말 시점의 낮아지고, 늦어지는 결과로 두 가지 물질의 경쟁적 저해 관계를  관찰 할 수 있었다.

휴지세포의 실험에서 CF와 DCM에 대해 다양한 농도와 OD로 분해 실험한 결과, OD의 변화가 주어지더라도 주입 농도가 높다면 초기 분해속도가 빨라진다는 것을 알 수 있었으며 OD의 변화에 따라서 초기속도가 크게 변할 수 있다는 사실도 알 수 있었다. 또한 Vmax값은 200이상의 높은 값을 얻을 수 있었다.

휴지세포와 일반성장 세포를 비교한 경우 초기분해속도에서는 큰 차이를 보이지 않으나 분해종말점이 휴지세포가 20%정도 빠른 결과를 얻었다.

b. CSTR test

생물반응기 배양시  flask배양시 보다보다 높은 성장속도(0.07∼0.09hr-1)를 얻었으며, 비교적 지연기가 길었다. 희석속도(dilution rate)는 0.04hr-1로 조정하여 OD 3에서 80ml/hr으로 배지를 주입하게 되었다. 그러나 배지의 연속적인 주입에도 불구하고 균체량은 계속적인 증가추세를 보였다. 이때 성장속도의 둔화를 목적으로 산소를 제한하였으나 큰 성과가 없었다. 결국 에너지원이며, 탄소원인 CH4을 50%이하로 제한한 결과, Fig 1.에 보듯이 비교적 안정된 상태를 확인 할 수 있었다. 여기서 성장구간이나 안정구간에서 각 sMMO의 활성, 즉 CF, DCM의 분해속도는 초기속도 면에서  균체량의 차이를 감안한다면 비교적 차이가 없다고 할 수 있으나, 고균체량에서 분해종말 시점이 앞당겨지는 결과를 얻었다. 또, 휴지세포상태나 탈기조작때의 결과와 비교하면 분해종말점이 40% 느린 결과를 알 수 있었고, 초기분해속도에서는 크게 차이가 없었다. 따라서 CH4이 경쟁적 반응을 야기하지만, sMMO의 활성에 영향을 주는 인자인 NADH의 증감에 도움을 주는 이유로 분해속도에는 크게 영향을 미치지  않을 수도 있는 결과를 얻었다.

따라서 CF나 DCM의 연속처리를 위하여 성장배양기(CSTR)와 분해반응기(PFR)가 분리된 이 단계 반응기를 도입했을 때 CSTR과 PFR사이에 탈기 반응기를 특별히 설치할 필요가 없음이 나타났으며, CSTR에서 성장된 세포를 그대로 PFR로 보내어 실험을 하여도 크게 무리가 없음을 알 수 있었다. CF와 DCM의 경쟁적 반응에 대한 자세한 실험이 진행되고, 연속배양의 재현성을 확보한 뒤 dilution rate의 변화를 주어 PFR에 대한 분해속도를 구한 뒤,  다양한 조건에 대한 분해 최적조건을 찾는다면, 실제 공정설계에 유용하게 활용될 자료가 될 것으로 사료된다.

감사

본 연구는 한국과학재단의 도움으로(핵심전문연구 971-1105-031-2) 수행되었기에 이에 감사드립니다.

참고문헌

Table 1. Degradation rates of chlorof -orm and dichloromethane by non-washed cells grown in CSTR		Table 2. Degradation rates of chlor -oform and dichloromethane

1.	David W. Grahm, Dick G. Korich et al Appl. Environ. Microbiol., Vol. 58, No. 7, pp 2231-2236, (1992)
2.	Hamamura Natsuko, Cyntia Page et al Appl. Environ. Microbiol., Vol. 63, No. 9, pp3607-3613, (1997)
3.	McDonald I. R., H. Uchiyama et al Appl. Environ. Microbiol., Vol. 63, No. 5, pp 1897-1904, (1997)
4.	Sun A. K., T. K. Wood, App. Microbial Biotechnol, 45, pp 248-256, (1996)
5.	Tsien Hsien-Chyang, Gregory A. Brusseau et al Appl. Environ. Microbil., Vol. 55, No. 12, pp 3155-3161, (1989)

chloroform
		air- stipped	no stripped
Vo (nmol/ mg protein·min)	80□M	17.89	15.51
	60□M	-	10.49
	40□M	8.396	5.16
	20□M	1.01	2.97
Vmax (nmol/ mg protein·min)		947	256
km (□M)		1176	105

Fig. 1. Proceeding of Continuous culture		Fig. 2. Degradation of CF by non-washed cell