Fe2(SO4)3와 미생물을 이용한 황화수소 제거 공정에 있어서 철 침전물(Jarosite) 생성 최소화 배지 개발

김태완, 김창준, 장용근,

한국과학기술원 화학공학과 및 생물공정연구센터

Medium Optimization for Minimization of Iron Precipitates(Jarosite) Formation in H2S Removal Process Using Ferric Sulfate and Microorganism

Tae Wan Kim, Chang Joon Kim, Yong Keun Chang

Dept. of Chemical Engineering and BioProcess Engineering Research Center,

Korea Advanced Institute of Science and Technology

서론

황화수소 가스 제거를 위한 화학/생물학적 복합공정은 경제적 측면, 오염물질 발생 측면에서 Claus process, Stretfold process, Iron chelate process에 비해 우수한 것으로 보고1)되었으나 상대적으로 느린 생물학적 반응에 의해 전체 공정의 효율이 크게 제한 받는 문제점을 안고 있으므로 많은 연구자들이 Fe(II) 산화속도를 증진시키기 위한 노력을 경주해 왔다. 그러나 이들이 우수한 반응기를 개발했음에도 불구하고 생성된 철 침전물(jarosite)이 반응기 및 line등을 막아(plugging) 반응기 운전에 심각한 악 영향을 초래하였다2). Kim 등은 원통형 깊이 필터에 세포가 고정화된 반응기를 이용하여 연속조업 시 철 침전물에 의해 필터가 막혀(plugging) 더 이상 장기 조업을 할 수 없음을 보고하였다3).

Thiobacillus ferrooxidans에 의한 철산화 반응에서의 철 침전물 생성 기작은 다음과 같다4).

3Fe3+ + M+ + 2HSO4- + 6H2O →   MFe3(SO4)2(OH)6 + 8H+(M=K+, Na+, NH4+, H3O+)

이론적으로  철침전물의 생성은 pH가 2.0 이상에서 배지중의 1가 양이온에 의해 촉진된다고 알려져 있다2). Halfmeier 등은 실란링에 고정화된 세포를 이용한 연속 조업 시 반응기내의 pH를 1.8이하로 낮게 유지하면서 철 침전물에 의한 영향을 최소화하기 위한 노력을 시도하였으나 이의 형성을 억제할 수 없었다5). 따라서 세포의 철산화 능력을 감소시키지 않으며 철 침전물 생성을 억제하기 위하여 pH와 같은 공정 운전 조건을 최적화하는 것 보다 근본적인 배지 개발이 필요하다.

본 연구의 목적은 철 침전물인 jarosite의 형성을 최소화할 수 있는 배지를 개발함에 있다. 그 내용으로서 기존의 9K 배지6)보다 염 농도를 현저하게 낮춘 배지, 질소원으로 사용된 (NH4)2SO4와는 다른 종류의 질소원이 함유된 배지, 인 공급원으로 사용된 K2HPO4가 제외되고 질소원으로서 (NH4)2HPO4 성분이 대체된 배지에서의 세포의 철산화 거동 및 철 침전물 생성에 대한 영향을 알아보았다.

재료 및 방법

사용 균주는 Thiobacillus ferrooxidans(ATCC 19859)이고, 균주의 배양은 초기 pH를 1.8로 조절한 Silverman의 9K 배지6)를사용했으며 그 조성은 다음과 같다: (NH4)2SO4 3 g/L; MgSO4·7H2O 0.5 g/L; K2HPO4 0.5 g/L; KCl 0.1 g/L; Ca(NO3)2·4H2O 0.014 g/L; FeSO4·7H2O 45 g/L. 종균 배양은 9K 배지가 5 L 들어있는 10 L 용량의 유리병에서 공기를 공급하면서 30oC에서 3일간 배양하였다. 이 배양액을 6000rpm에서 20분간 원심분리하여 세포를 회수하고, FeSO4·7H2O가 제외된 pH 1.8의 9K 배지(mineral salt 용액)로 현탁한 후 다시 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수된 세포를 FeSO4·7H2O가 제외된 pH 1.8의 9K mineral salt 용액 100mL에 현탁하여 보관하면서 접종원으로 사용하였다. 플라스크 배양 시 50 mL의 배지를 함유한 250 mL 플라스크에 증류수로 적절히 희석한 접종균 5mL을 접종하였다. 이때 접종균의 농도는 세포내 단백질 농도 기준으로 53 □g-protein/mL이였다. 초기 pH는1.8로 조절하였고 온도는 30oC, 교반속도는 250 rpm이었다.

철 농도는 1,10-phenanthroline method를 사용하여 정량하였다7). 채취한 시료를 10,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 세포와 침전물을 제거한 후, 상등액을 적절히 희석하여 0.1  mL를 취하여 1,10-phenanthroline reagent 0.4 mL를 섞고, 증류수로 2.5 mL까지 맞춰 상온에서 10분간 발색시킨 후, UV/VIS spectrophotometer(Hewlett Packard 8453, San Francisco, USA)를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하여 Fe(II) 농도를 정량하였다. 총 철 농도 정량은 희석된상등액 0.1 mL에 환원력이 강한 환원제인 10 % hydroxylamine hydrochloride 수용액 0.1 mL을 첨가하여 Fe(III)를 Fe(II)로 환원시킨 후, 상기의 방법으로 정량화하였다. Fe(III) 농도는 위에서 구한 총 철 농도와 Fe(II) 농도 차로 계산하였다.

철 침전물(jarosite)의 성분분석을 위하여 배양후 여과지(whatman,no.1, pore size: 11□m)를 사용하여  철 침전물을 회수하였다. 이를 80oC의 건조기에서 12시간 말린 후 SEM-EDX와 ICP분석을 수행하였다. ICP분석을 위해서 철 침전물 0.15 g을 5 mL의 왕수(HCl:HNO3=3:1)에 녹인 것에 증류수로 총 25g이 되게 희석하였다.

결과 및 고찰

Thiobacillus ferrooxidans에 의한 철산화 시, 철 침전물이 생성되고, 이러한 철침전물의 생성은 언급하였듯이 배지 중에 함유된 1가 양이온에 의해 촉진된다고 알려져 있다2). 따라서 배지중의 전체적인 염(salt) 농도를 낮추었을 경우, 세포에 의한 철산화 거동 및 철 침전물 생성을 고찰하였다. 9K medium에 비해 염 농도를 최고 1000배까지 희석시켜도 철 침전물의 생성을 억제할 수 없었다. 따라서 철 침전물 생성을 촉진시키는 배지성분 규명 및 이의 방지를 위한 체계적인 접근을 위해 초기 pH 2.2로 조절한  9 K medium에서 균주 배양 시 생성된 철 침

표1. ICP분석에 의한 철 침전물의 조성

Element	Weight(% composition)
P	0.48
K	2.9
Fe	36.7
S	11.1
Mg	1.5×10-3
Ca	3×10-3

그림1. 철 침전물의 SEM-EDX 스펙트럼

전물을 회수하여 SEM-EDX 및 ICP 분석을 수행하였다. 그 결과, 1가 양이온인 칼륨과 황이 철 침전물을 형성하는 주요 성분임을 알 수 있었다(그림1, 표1).

따라서 후속 연구로써 9K 배지의 질소원인 (NH4)2SO4를 황 성분을 포함하지 않는 질소원인 NH4Cl, 암모늄 이온을 포함하지 않는 질소원인 HNO3, 그리고 인 및 칼륨원으로 사용된 K2HPO4성분을 제외하는 대신 인 성분이 첨가된 질소원인 (NH4)2HPO4 성분 등으로 각각 대체하여 철 침전물 형성에 대한 그 영향을 고찰하였다. NH4Cl 사용 시 철 침전물이 다량 생성되었고, 또한 HNO3 사용 시에는 세포 활성이 뚜렷하게 감소하여 철 산화가 거의 일어나지 않는 것을 확인하였다. 이것으로부터 철침전물 중의 황 성분은 질소원인 (NH4)2SO4보다는 FeSO4에서 유래되었다고 유추할 수 있다. 또한 HNO3는 세포의 철산화 활성을 저해함으로 질소원으로 사용할 수 없음을 알 수 있었다. 그러나 질소 및 인원으로 (NH4)2HPO4 사용 시 9K 배지에 비해 세포 활성 감소가 없음은 물론 철 침전물 생성이 전혀 없었다. 즉, 그림 2에 나타낸 바와 같이 9K 배지와 본 연구에서 개발한 배지를 비교 시 Fe(II)가 완전히 산화되는 시간, 즉, 철산화 속도는 비슷하였고, 그 시점에서의 총 철농도는 9K 배지는 6,6 g/L인 반면, 본 연구에서 개발한 배지는 8.2 g/L임을 보여주었다. 이러한 결과를 좀 더 구체적으로 알아보기 위하여 9K 배지에서  K2HPO4 성분을 H3PO4 성분으로 대체하여 고찰한 결과 그 농도 증가에 따라 철 침전물이 현저히 감소하는 것을 확인하였다.

(a)                                  (b)

그림2. 9K 배지와 Modified 9K 배지에서의 Thiobacillus ferrooxidans의 철산화            거동 및 철 침전물 형성: (a)  Fe(II) , (b) Fe(total) (□ 9K 배지 , □              Modified 9K 배지)

따라서 배지 중의 철 침전물의 형성을 억제하는 조건은 칼륨이온을 최소하 하는 것은 물론 적정 농도의 인 성분이 함유되는 배지에서 철침전물 형성이 현저히 감소하는 것으로 결론 지울 수 있다.

또한 celite bead가 50% 첨가된 두 경우의 배지에서 세포의 철산화 거동을 고찰한 결과 철 침전물 생성정도는 현탁세포 배양에 비해 훨씬 두드러졌다. 9K 배지에서의 최종 총 철농도는 4.74 g/L인 반면 본 연구에서 개발한 배지(modified 9K)에서는 7.84 g/L였다. 즉, 9K 배지에서 celite bead는 철침전물 생성을 촉진시켰으나, 본 연구에서 개발한 배지에서는 그러한 현상이 전혀 없었다. 화학생물학적 복합 공정에서 사용되는 생물반응기에는 현탁세포보다 고정화세포를 이용하는 것이 훨씬 유리하다3).

Celite bead는 세포 고정화용 담체로 널리 사용되고 있어,  세포 고정화 담체로 이용한 경우 세포 고정화 효율은 좋았으나, 9K 배지에서 철 침전물을 다량 생성시킴으로써 조업을 불가능하게 하였다. 그러나 본 연구에서 개발한 배지는 이러한 문제점을 해결해 줌으로써, 셀라이트를 세포 고정화 담체로 사용할 수 있게 하였다. 이것은 적절한 배지 개발을 통해 세포 고정화 담체 선택의 폭을 넓힐 수 있는 계기가 되었다는점에서도 그 잇점이 크다고 말할 수 있다.

참고문헌

1. Jensen, A. B. and C. Webb.: Enzyme Microbiol. Technol., 17, 2(1995)

2. Jensen, A. B. and C. Webb.: Proc. Biochem., 30, 225(1995)

3. Kim, C. J., T. H. Lee, and Y. K. Chang.: Korean J. Biotechnol. Bioeng., 12,        562(1997)

4. Grishin, S. I., J. M. Bigham, and O. H. Tuovinen.: Appl. Environ.                  Microbiol., 54, 3101(1988)

5. Halfmeier, H., W. Sch□fer-Treffenfeldt, and M. Reuss.: Appl. Microbiol.             Biotechnol., 40, 582(1993)

6. Silverman, M. P. and D. G. Lungren.: J. Bacterial., 77, 642(1959)

7. Vogel, AI, Textbook of Quantitative Chemical Analysis, 5th. ed., Lpngman,          London(1989)