전기크로마토그래피를 이용한 거대분자의 분리

김백암, 류화원

전남대학교 생물화학공학과

Separation of Macromolecules using Electrochromatography

Baek-Ahm Kim, Hwa-Won Ryu

Department of Biochemical Engineering

Chonnam National University, Kwangju, 500-757, Korea

서론

전기크로마토그래피(Electrochromatography,EC)는 젤 여과용 매체로 충전된 칼럼에 전기장을 결합시킨 액체 크로마토그래피의 한 형태로서 분자량, 전기이동도, 용질체류에 기초하여 생물 거대분자의 분석과 분리정제에 적합한 분리공정이다.

생화학, 분자 생물학, 유전공학 등의 발전과 함께 최근의 여러 연구에서 생체분자의 혼합물의 분석을 목적으로 EC가 사용되고 있다. 뿐만 아니라 새로운 산물로서 등장하는 생체 거대분자의 대규모적인 분리 및 정제는 생물산업의 중요한 연구 분야 중의 하나가 되고 있으며 식품학 분야 및 새로운 치료제로 사용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 연구에서는 EC system을 이용하여 단백질과 DNA의 분리효과를 알아보기 위해 Calf thymus DNA(Cf-DNA)와 Bovine serum albumin(BSA)의 전기장에 의한 용출거동을 관찰하였다. 0-10V/cm 범위의 전기장세기에서 전기장의 극성을 바꾸어가며 칼럼내 용질의 체류시간을 측정하였으며, 전기장의 극성이 분리에 미치는 영향을 조사하였다. 전기장의 극성은 전극이 칼럼의 출구에 양의 전극이 걸렸을 때를 양극성으로, 그 반대의 경우에 음극성으로 정의하였다(Fig. 1).

이론

대류, 전기이동도, 농도분극은 EC의 용질속도에 기여하는 주요 인자이다. [eqn: v_c]로 표현되는 크기배제 크로마토그래피 속도의 방향은 농도분극속도[eqn: v_cp] 와는 반대이며 전기이동속도[eqn: v_e]는 전기장의 방향에 의존한다. EC에서 용질 속도(u)는 다음과 같이 용질 속도 항들의 벡터합으로 나타내어질 수 있다.

u[eqn: =SUM from { { i}=0} to n]vi = vc + ve + vcp                                       (1)

여기서 vi는 속도벡터를 나타낸다. 일반적인 크기배제 크로마토그래피 이론에 전기적 항을 결합하면 다음과 같이 EC에서의 용질속도를 계산할 수 있다.

[eqn: u={ v+alpha mu_1 E + (1-alpha)K_av mu_2 E } over { alpha+(1-alpha)K_av +(1-alpha)(1-K_av )k_p}]                              (2)

여기서 [eqn: v]는 공탑속도이다. 분극 흡착 함수,[eqn: k_p]는 다음과 같다.

[eqn: k_p = exp(a vert {E over v} vert )-1]                                              (3)

따라서 크로마토그래피 속도, 전기이동 속도, 농도 분극 속도는 각각 다음의 식들로 표현될 수 있다.

[eqn: v_c = v over {alpha + (1-alpha)K_av}]                                                 (4)

[eqn: v_e = muE]                                                             (5)

[eqn: v_cp = v over{alpha+(1-alpha)K_av} - {v+alphamu_1 E+(1-alpha)K_av mu_2 E} over {alpha+(1-alpha)K_av + (1-alpha)(1-K_av )k_p } +- muE]       (6)

속도 성분 [eqn: v_cp]는 서로 다른 용질의 농도분극 속도 효과를 나타낸다. 식 (1)과 (6)은 전기장에서 유도된 농도분극 효과가 포함된 거대분자들의 체류속도를 계산할 수 있게 한다.

실험

테프론 마개가 부착된 이중관 칼럼에 Sephadex G-75 크기배제 젤을 충전시켰다. 칼럼 위쪽에 두 개의 3-way 콕크가 달린 주입기를 통해 시료를 주입시켰으며 양쪽마개에 달린 구멍을 통해 백금전극을 설치하고 전해액이 흐르도록 하였다. TGE(3.9mM Tris, 47mM Glycine, 0.25mM EDTA)와 TG(3.9mM Tris, 47mM Glycine)를 완충액으로 사용하였다. 전기이동용 전력공급장치를 이용하여 칼럼에 전원을 공급시켰으며 칼럼내 온도구배를 최소화하기 위해 냉각 순환조의 온도는 4oC로 유지시켰다. 칼럼 밖으로 용출되는 단백질과 DNA의 크로마토그램을 측정하였으며 용출액은 분별 수집기를 이용하여 분획 수집하였다. 수집된 시료는 SDS-PAGE와 Agarose 젤 전기영동을 수행하여 시료의 분리 여부를 확인하였다. Table 1에 실험 조건을 나타냈다.

결과 및 고찰

Sephadex G-75 크기배제 젤로 충전된 EC 칼럼에서 0-10V/cm 범위의 전기장세기와 0.2-1.0ml/min 범위의 유량을 사용하여 Cf-DNA와 BSA의 전기장 세기와 극성에 대한 체류시간의 영향을 관찰한 결과 음극성, 0.8ml/min, 10V/cm의 전기장 세기에서 BSA는 칼럼 밖으로 용출되는 반면 Cf-DNA는 칼럼내에 체류하였다가 전기장을 끄고 난 후에 용출되었다(Fig. 3,4). 이는 식 (1)의 정의에서 처럼두 용질간에 서로 다른 전기이동 속도[eqn: v_e]와 분극흡착 속도[eqn: v_cp]에서 기인한다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 양극성 전기장 보다는 음극성 전기장이 용질체류에 더 효과적임을 알 수 있으며 이것은 칼럼내 전기이동 속도[eqn: v_e]의 방향 변화가 가장 큰 요인이라고 할 수 있다. Fig. 5.a-6.b는 SDS-PAGE와 Agarose 젤 전기영동을 통하여 EC를 수행하기 전과 후의 두 혼합물의 분리 여부를 각각 보여주고 있다. EC수행 전에는 같은 fraction내에 두 용질이 함께 존재함을 보여주고 있으나 EC를 수행하고 난 후에는 두 혼합물이 분리되었음을 보여준다. 따라서 본 실험을 통하여 유속, 전기장 세기 및 극성의 적절한 선택에 의해 효과적인 분리를 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

Table 1. Operating Conditions of Electrochromatography System

Column	1.5[eqn: TIMES]10cm jacketed glass column(Ace Glass)
Packing material	Sephadex G-75 size exclusion gel(Sigma)
Buffer	TGE(3.9mM Tris, 47mM Glycine, 0.25mM EDTA) and TG(3.9mM Tris, 47mM Glycine), pH 8.1
Flow rate	0.2-1.0ml/min(Top to Bottom)
Sample	Calf thymus DNA(0.1mg/ml, Sigma) Bovine serum albumin(2mg/ml, Sigma)
Polarity	negative or positive(Fig. 1)
Voltage	0-100V
Detector	UV detector(ISCO, 254nm and 280nm)

Fig. 1. EC column with a mechanistic      Fig. 2. Change of retention time on electric        hypothesis of solute component            field strengths and polarities at the

velocities.                                 flow rate of 0.8ml/min.

Fig. 3. Elution behavior in EC column       Fig. 4. Elution behavior in EC column

with zero voltage and flow rate of          with negative polarity of 10V/cm and

0.8ml/min.                                  flow rate of 0.8ml/min.                                                        Fig. 5.a. Agarose gel electrophoresis         Fig. 6.a. Agarose gel electrophoresis of

of selected fractions from Fig. 3.            selected fractions from Fig. 4.

Fig. 5.b. SDS-PAGE of selected fractions    Fig. 6.b. SDS-PAGE of selected fractions

from Fig. 3.                                from Fig. 4.

* P : BSA Standard,   D : Cf-DNA Standard

참고문헌

1. S. R. Rudge, S. K. Basak, and M. R. Ladisch, "Solute Retention in Electrochromatography by Electrically Induced Sorption", AIChE J., 39(1993).