재조합 대장균에 의한 생물접착제 Precursor의 생산

김 연철, 이 상엽, 장 호남

한국과학기술원, 생물공정연구센터/화학공학과

Production of Bioadhesive Protein Precursor Using Recombinant Escherichia coli

Yeon Chul Kim, Sang Yup Lee, and Ho Nam Chang

BioProcess Engineering Research Center and Department of Chemical Engineering,

Korea Advanced Institute of Science and Technology

서 론

접착제는 우리 생활에서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 이 접착제는 서로 다른 물질을 연결시켜 결합된 부위에서 stress의 분포를 좋게 하고, design flexibility를 증가 시켜 비용 절감효과를 가져온다.  많은 일반적인 접착제는 건조한 상태에서는 아주 좋은 특성을 나타내나, 바다, 의료용, 또는 치과용 등의 수분이 있는 조건에서는 그 특성을 잃어버려 사용이 불가능하다.  그래서 많은 연구자들이 접착 특성을 가지는 자연 단백질의 사용 가능성에 초점을 맞추어 왔다.  이러한 접착 특성을 가지는 자연 단백질로 난류가 심한 바다 속에서 고체물질에 붙어살고 있는 홍합 (mussels), 굴 (oysters), 따개비 (barnacles) 등이 특히 관심을 끌게 되었다.  이 중 홍합에서 생산되는 접착단백질이 연구가 많이 진행되어져 있다.  홍합은 족사 (byssus)에 의해 바위 등에 고착생활을 하는 데, 이 족사는 stem, ring 구조에 의해 stem에 붙어있는 multiple threads와 고체물질에 thread를 붙이는 역할을 하는 각각의 thread의 끝에 있는 digital adhesive disc로 구성되어져 있는 단백질 복합체이다[1].  이 단백질의 아미노산 조성은 13%의 Hyp (Hydroxyproline), 11%의 Dopa (3,4-dihydroxyphenylalanine)와 함께 6개의 아미노산 (Lysine, Alanine, Serine, Threonine, Proline, Tyrosine)이 90% 정도이다[2].  또한 이 단백질은 hexapeptide나 decapeptide로 구성되어져 있으며, 이의 아미노산 서열은 Ala-Lys-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Tyr-Lys 의 hydroxylation variants가 대부분이다[3].  홍합접착단백질 (MAP)의 발현을 위한 미생물 system을 개발하기 위해 Genex 연구팀은 Mytilus edulis의 phenol gland mRNA로부터 cDNA libraries를 제작하여 MAP는 hexapeptide나 decapeptide의 tandem repeats로 구성되어져 있음을 밝혔고[4], Filpula 등은 이를 yeast에서 발현시켰다[5].  Salerno와 Goldberg[6]는 좀 다른 방향으로 생물접착제를 encoding하는 유전자를 합성하여, Escherichia coli에서 높은 수율로 발현을 시켰다.  그러나 위의 연구들은 모두 플라스크에서의 실험이므로, 본 연구에서는 생물접착제 단백질의 크기에 따른 발현량을 비교하고, 이를 대량생산하기 위해 유가식 배양을 수행하였다.

재료 및 방법

Bacteria and Plasmids: 생물접착제 precursor (MAPP)의 발현 숙주로는 E. coli BLR [DE3] (F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm D(srl-recA) 306::Tn10 (DE3)) (Novagen, Madison, WI)를 사용하였고, plasmids는 Dr. Goldberg로 부터 얻은 pAG9[6]을 개량하여 만든 pKYC0.3, pKYC0.8과 pKYC1.2를 사용하였고, 그의 유전자 지도를 Fig. 1에 나타내었다.

Figure 1. Plasmid restriction map. (MAPP sizes are 0.3, 0.8 and 1.2 kb.)

Growth Media and Fed-Batch Culture: 접종배지는 100 □g/mL의 ampicillin과12.5 □g/mL의 tetracycline을 첨가한 LB 배지를 사용하였고, seed는 37 ℃, 250  rpm의 shaking incubator에서 overnight하였다.  유가식 배양 시 배지의 조성 (g/L)은 Glucose; 5, Yeast extract; 5, (NH4)2HPO4; 4, KH2PO4; 13.3, MgSO4·7H2O; 1.2, Citric acid; 1.7, Trace metal solution; 10 mL.  여기서 Trace metal solution의 조성은 CuSO4·5H2O; 1, FeSO4·7H2O; 10, ZnSO4·7H2O; 2.25, MnSO4·4-5H2O; 0.5, CaCl2·2H2O; 2, Na2B4O7·10H2O; 0.23, (NH4)6Mo7O24; 0.1, 35% HCl; 10 mL이다.  모든 유가식 배양은 37 ℃에서 2.5 L의 발효기에서 수행하였고, pH는 28%의 암모니아수로 7.0으로 조절하였다.  초기부피는 100 mL의 seed culture를 첨가하여 1 L가 되도록 하였다.  용존산소량은 10% 이상을 유지하도록 stirring 속도를 300에서 1200 rpm으로 조절하였고, 필요 시 산소를 공급하였다. 배지 공급은 induction 전에는 exponential feeding method를 사용하였고, induction 후에는 constant feeding method를 사용하였다.  흡광도 60에서 0.24 g (1mM)의 IPTG를 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다.

분석 방법: 세포농도는 600 nm에서 흡광도를 측정하였고, 포도당 농도와 초산 농도는 HPLC를 이용하여 분석하였다.  단백질의 정량분석은 12%의 SDS-PAGE를 densitometer (ImageMaster, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)로 scan하였다.  총 세포 단백질은 Bovine Gamma Globulin을 standard로 Bradford 방법에 따라 결정하였다.

결과 및 고찰

MAPP를 생산하기 위해 유가식 배양을 수행하였고,  그 결과를 Fig. 2에 나타내었다.  Fig. 2에서 보여주듯이, MAPP의 크기가 증가함에 따라 induction 후에 성장속도가 증가함을 보이고 있다. 특히 BLR(DE3) pKYC0.3의 경우 다른 두 균주와는 다르게 induction 후에 세포 성장이 멈추는 현상을 보이고 있다.  이러한 현상의 원인은 아직까지 밝혀지지 않았다.  따라서 최종 OD는 BLR(DE3) pKYC0.3의 경우에는 71까지 올라갔고, BLR(DE3) pKYC0.8과 BLR(DE3) pKYC1.2의 경우는 각각, 166, 162 까지 올라갔다.  Fig. 3은 BLR(DE3) pKYC0.8의 SDS-PAGE의 결과를 나타내고 있다.  Induction후부터 22.2 kDa의 MAPP가 축적되기 시작하여, 7시간이 지났을 때, 총 단백질의 약 30 %까지 증가하였다.  이로부터 MAPP의 농도를 구하면 약 9.8 g/L가 된다.  Fig. 4는 BLR(DE3) pKYC1.2의 SDS-PAGE의 결과이다.  Induction후42 kDa의 MAPP가 축적되기 시작하여, 7시간이 지났을 때, 총 단백질의 약 18 %까지 증가하였고, 이는 4.0 g/L의 단백질 농Figure 2. Growth curve of BLR(DE3) pKYC series.

도이다.  BLR(DE3) pKYC0.3의 경우에는 MAPP가 SDS-gel 상에서 보이지가 않았다.  pKYC0.8과 pKYC1.2의 MAPP의 발현량은 MAPP 유전자의 크기가 증가함에 따라 감소되어짐을 볼 수 있다.  이는 tandem repeats의 발현에 있어서 다른 문헌에 보고된 것과 일치함을 보이고 있다.  위의 실험 결과를 Table 1에 정리하였다.

Table 1. Summary of fed-batch fermentation results.

Plasimd	Final OD	Maximum Protein % [OD]	Protein Conc. (g/L)
pKYC0.3	71	Not detected	-
pKYC0.8	166	30.5 [161]	9.8
pKYC1.2	162	18 [111.5]	4.0

Figure 3. SDS-PAGE of BLR(DE3)pKYC0.8 cell extract. (M: molecular weight	maker, A and B mean after and before induction, respectively.  The number	is time.)

Figure 4. SDS-PAGE of BLR(DE3)pKYC1.2 cell extract. (M: molecular weight	maker, A mean after induction.  The number is time.)

참고문헌

1. Ou, J.-J.:Ph.D. Dissertation, Boston Univ., Boston, USA(1990).

2. Waite, J. H. And Tanzer, M. L.: Science, 212, 1038(1981).

3. Waite, J. H., Housley, T. J., and Tanzer, M. L.: Biochemistry, 24, 5010(1985).

4. Strausberg, R. L., et al.: in "Adhesives from Renewable Resources (Hemingway	R. W. and Conner, A. H. eds.)", ACS Sym. Ser., 385, 453(1989).

5. Filpula, D. R., et al.: Biotechnol. Prog., 6, 171(1990).

6. Salerno, A. J. and Goldberg, I.: Appl. Microbiol. Biotechnol., 39, 221(1993).

Acknowledgments

pAG9 plasmid를 제공하여 주신 Dr. Ina Goldberg에게 감사 드립니다.  본 연구는 생물공정 연구센터의 지원과 기관 고유사업으로 수행되었으며, 이에 감사드립니다.