Thiophilic PolyHEMA의 제조와 이를 이용한 IgG의 회분식 분리실험

임재홍, 조영일

연세대학교 공과대학 화학공학과

Preparation of Thiophilic PolyHEMA and Batch-type Separation of IgG

Jae-hong Im, Yung-il Joe

Dept. of Chem. Eng., College of Eng., Yonsei Univ.

서론

항체는 고부가가치의 의약용 소재로서 난치성 질병의 증가와 국민의료 수준의 제고에 따라 진단, 약물운반, 생분리 등에서 핵심적인 상품으로 평가되고 있을뿐만 아니라 환경, 생물농업, 식품분야에서도 사용되고 있다. 항체들중 대표적인 IgG는 혈청 1 ml 당 약 12 mg의 농도로 분포하고 있으며, 척추동물 면역방어의 일차 작용제인 당단백질이다. 이러한 IgG를 분리정제하기 위해 주로 사용된 것은 Protein A 또는 Protein G 등과 같이 IgG에 특이 친화성을 갖는 천연 고분자들이다. 그러나 이러한 천연 고분자들은 생산 및 분리가 고비용인 까닭에 항체의 생산비가 높다는 단점을 갖고 있다[1-4].

Thiophilic 흡착은 1985년에 Porath 등에 의해서 제안된 새로운 크로마토그래피법으로서 혈청, 복막액, 조직배양 부양액, 초유 유청, 치즈 유청 등에서 Ig을 직접 정제하는데 사용되었다[5-10]. 이러한 형태의 흡착은 화학적 안정성, 그리고 리간드의 높은 특성결합과 같은 성질을 갖어 많은 연구자들로 하여금 Protein A, G와 같은 기존의 고가 천연단백질 리간드의 대체물로서 관심을 갖게하였다. 그러나 기존의 thiophilic 물질은 agrose를 담체로 하였는데, 이는 agarose라는 천연 단백질이 갖는 단점인 물리□화학적 내구성 부족이라는 문제점들이 있게 된다.

본 연구에서는 thiophilc 작용 담체를 agarose가 아닌 PolyHEMA로 하였다. 이는 선행 연구들[11,12]에서 얻은 최적의 변수값들로 제조하였으며, DVS와 □-mercaptoethanol로 PolyHEMA를 thiophilic화 하고, 이를 이용하여 IgG에 대한 회분식 분리 실험을 하였다. Thiophilic 분리 실험은 K2SO4, (NH4)2SO4, Na2SO4등 염의 종류와 그 농도에 따른 IgG의 흡착량을 알아보았으며, 선택된 염의 종류와 농도에서의 IgG의 초기 농도에 대한 흡착량을 알아보았다.

실험 방법

1. Thiophilic PolyHEMA 제조 실험

현탁중합을 통하여 제조된 PolyHEMA를 활성매체의 pH, 반응시간, 초기 DVS의 농도 그리고 결합매체의 pH, 반응시간 및 □-mercaptoethaol의 농도를 변수(Sigma)로 하여 thiophilic PolyHEMA(이하 T-PHEMA)로 제조하였다. 제조된 PolyHEMA는 divinylsulfone(DVS)을 이용하여 활성화시켰으며, FT-IR과 CHNS-O를 이용하여 반응도와 결합된 DVS의 양을 측정하여 가장 많이 활성화된 변수들에서 □-mercaptoethanol 결합을 행하였다. 이 후 세척된 활성화물은 증류수로 세척하여 회분식 IgG의 분리실험까지 4 ℃에서 0.02 %의 NaN3에 보관 하였다. 이들의 활성□결합 여부 및 활성□결합량은 FT-IR(ATI Mattson Genesi Series)을 통하여 정성적으로, CHNSO analyzer (FISONS ins. EA 1108 CHNS-O)를 사용하여 정량적으로 확인하였다.

2. 회분식 IgG의 분리 실험

T-PHEMA를 이용하여 IgG 흡착에 대한 염의 영향을 알아보고자 다음의 염들 K2SO4, (NH4)2SO4, Na2SO4에 대하여 0.1, 0.25, 0.35, 0.45, 0.55, 0.7 molL로 농도를 변화시키며 흡착 실험을 행하였다. 이 때 흡착 완충액으로는 pH 7.0의 0.05 mol/L의 sodium/potassium phosphate를 사용하였으며 반응 온도는 20 ℃로 하였다. 반응기는 용기에 대한 IgG의 흡착을 최소화하기 위하여 Polypropylene 재질의 것을 사용하였다. 반응기 내부를 충분히 교반시키며, IgG의 물리적인 훼손을 막기위하여 직접 교반 대신 shaker를 이용하였으며, 교반 속도는 120 rpm으로 하였다. 초기 IgG의 농도에 대한 흡착량 평가 실험도 위한 동일한 변수를 사용하였으며, 각 실험에서의  IgG 흡착량은 U.V. spectrometer(Shimazu Doule Beam Spectro Photometer UV-200S)를 이용하여 280 nm에서 측정하였다.

결과 및 토론

Table 1은 DVS와 □-mercaptoethanol을 이용한 PolyHEMA의 thiophilic 담체화에 따른 각 실험 변수들에 대한 □S□의 결합 농도를 나타낸 것이다. 활성화 및 결합 과정에서의 매개물은 0.1 및 0.5 mol/L의 Na2CO3 용액이며, 반응온도는 25 ℃였다. DVS에 의한 활성화는 매개물의 pH에 큰 영향을 받았으며, 강염기일수록 반응이 더욱 촉진된다는 것을 알 수 있었다. 반응 시간과 DVS의 초기 농도는 활성화도에 선형적인 영향을 주지만 일정한 양 이상에서는 변수값의 증가분의 역할이 없었다. 활성화 과정에서 초기 DVS의 농도 1.0 mol/L, 반응시간은 16 시간 그리고 매개물인  0.5 mol/L의 Na2CO3 용액의 pH가 13일 때 최대 □S□의 결합 농도인 88.51 mg S/g PolyHEMA를 얻을 수 있었다. □-mercaptoethanol을 이용한 결합 과정에서는 pH 10.5까지는 결합량이 증가하였으나 그 이상에서는 오히려 감소하여 활성화 과정과는 비교가 되었다. 그러나 초기 □-mercaptoethanol의 농도와 반응시간의 영향성은 결합과정과 유사하였다. 농도 8.0 mol/L, 반응시간은 36 시간 그리고 0.1 mol/L의 Na2CO3 용액의 pH가 10.5일 때 최대 □S□의 결합 농도 94.9 mg S/g PolyHEMA를 얻을 수 있었다. 따라서 이 후 IgG의 회분식 분리 실험에서는 이를 이용하였다.

Fig. 1은 T-PHEMA의 IgG에 대한 흡착에서의 K2SO4 염의 농도 영향을 나타낸 것이다. 사용된 T-PHEMA의 양은 0.3 g 씩이었으며, 이 때 IgG의 농도는 0.5 mg/ml였다. 반응 시간은 1 시간, 흡착 완충액은 0.05 mol/L의 sodium/ potassium phosphate이었다. 염의 농도가 증가할수록 흡착도(C/C0)는 26 %에서 67.7 %로 증가하여 약 260 %의 증가도를 보였다. 이를 통해 thiophilic 흡착이 염의 농도가 증가함에 따라 일정값까지 증가하는 salt-promoted 현상임을 확인할 수 있었다. 이와 유사한 결과를 다른 논문들[13,14]에서도 찾아볼 수 있었다. K2SO4 염의 경우 농도가 0.5 mol/L 이상인 경우는 농도 증가에 상관없이 거의 일정한 흡착량을 보였으며, 이 때 T-PHEMA의 흡착용량은 1.13 mg IgG/g T-PHEMA이었다.

참고 문헌

1. Greg T. Hermanson, □Immobilized affinity ligand techniques□, 1992.

2. Stryer, L. □Biochemistry□ 3rd. 1988.

3. Denizli, A. D., Ras, A. Y. and Piskin, E., J. Chrom. B, 668, 13(1995).

4. Howard, A. and Draeger, N. M. J. Chrom., 597, 129(1992).

5. J. Porath, F. Maisano and M. Blew, FEBS Lett., 185, 306(1985).

6. K.L. Knudsen, M.B. Hanson, L.R. Herickson, A. Lihme, Anal. Biochem.,

201, 170(1992).

7. M. Blew, N. Juntti, A. Larson and J. Porath, J. Imm. Methods, 102, 173(1987).

8. B, Nopper, F. Kohen and M. Wilchek, Anal. Biochem., 1989, 66-71.

9. T.W. Hutchen, J.S. Magnusen and T.T. Yip, J. Imm. Meth., 128, 89(1990).

10. P. Konecny, R.J. Brown and W.H. Scouten, J. Chrom. A, 673, 45(1994).

11. 임재홍, 한학수, 김중현, 조영일, 화학공학의 이론과 응용, 제2권, 제2호,

1331-1334 (1996)

12. 임재홍, 오경석, 한학수, 김중현, 조영일, 화학공학의 이론과 응용, 제3권,

제1호, 1217-1221 (1997)

13. Oscarson, S., Medin, A. and Porath, J., J. Colloid Int. Sci., 152, 114(1992).

14. Nilsson, K. and Mosbach, K., Biochemistry, 26, 7199(1987).

감 사

본 연구는 □교육부, 1997년도 학술연구조성비; 생물화학공학 분야□의 지원으로 이루어졌으며, 이에 감사를 드립니다.

Fig. 1. The effect of concentration of K2SO4 on the

adsorbity of IgG to thiophilic PolyHEMA.

Table 1. The amount of sulfur on PolyHEMA by activation and coupling

procedures

Procedure	Parameters
	medium pH act:(1 mol/L, 12 hr) cop.:(8 mol/L, 24 hr)		Time(hr) act:(1 mol/L, pH=11.5) cop.:(8 mol/L, pH=10.5)		Conc.(mol/L) act:(pH=11.5, 4 hr) cop.:(pH=10.5, 4 hr
	variables	conc. (%)	variables	conc. (%)	variables	conc. (%)
Activation with DVS	7.5	0.060	4	5.511	0.1	2.448
	8.5	0.4108	8	6.301	0.4	3.776
	10	2.763	12	3.950	0.7	4.730
	11.5	6.864	16	6.792	1.0	5.511
	13	8.851	-	-	1.4	5.10
Coupling with □-mercap- toethanol	6	8.714	6	8.045	4	8.721
	7.5	8.841	12	8.799	6	9.170
	9.0	8.916	18	9.195	8	9.207
	10.5	9.015	24	9.205	10	9.172
	12	8.966	36	9.497	12	8.896
	-	-	48	9.452	16	8.936