Soybean peroxidase의 추출공정 및 반응특성

서 경 림, 이 은 규

한양대학교 화학공학과 생물공정연구실

Extraction Process and Reaction Characteristics of Soybean Peroxidase

Kyung Lim Suh, Eun Kyu Lee

Department of Chemical Engineering

Hanyang University

서론

Peroxidase (donor: hydrogen peroxide oxidoreductase, EC.1.11.1.7)는 과산화수소(H2O2)를 분해시키는 반응을 촉매하는 효소이다(1).  대표적인 peroxidase인 horseradish peroxidase (HRP)의 추출 및 응용에 관한 연구가 대부분이었으나 최근에는 HRP에 비해 월등한 열안정성 및 경제성을 갖는 soybean peroxidase (SBP)에 대한 연구에 관심이 집중되고 있다(2-4).  본 실험에서는 값 싼 soybean hull (대두피)로 부터 고부가가치의 peroxidase를 추출하여 열안정성과 pH 안정성, 분자량과 pI 등의 특성을 알아보고 SBP의 과산화수소 분해능력을 평가비교하였다.

실험 재료 및 방법

본 실험에서 사용한 soybean hull은 (주)삼양유지에서 제공받았으며 효소활성 측정에 이용한 guaiacol과 과산화수소 및 SBP와 HRP 표준물질은 Sigma사에서 구입하였다.  Bio-Rad사의 Rotofor system을 이용하여 SBP의 pI를 결정하였다.  SBP의 활성은 Sesta와 Anderson의 측정방법(5)을 따랐고 단백질 정량은 BSA를 표준물질로 하여 Bradford 분석법으로 하였다.  과산화수소의 정량분석은 Bishop 등의 방법(6)을 따랐다.

SBP의 추출공정

Soybean hull에서 peroxidase를 추출하기 전에 hull과 같이 섞여 있는 대두 조각을 밀도차에 의해 완전히 제거하였다. 순수한 hull 25 g을 수돗물 200 ml에 넣고 40℃로 중탕하면서 30분 정도 교반한 후 hull을 제거하고 남은 추출액에 다시 200ml이 되도록 물을 채운 후 25g의 hull을 넣고 같은 방법으로 처리 하기를 6회 반복한 후 추출액을 12,000xg로 20분간 원심분리하여 고형물을 제거하였다. 거대 분자량 물질을 제거하기 위해 염처리 (CaCl2 1%, K2HPO4 0.5%), pH 처리 (pH 9-11), 열처리 (80℃에서 10분간)를 하였다. 전처리한 액을 다시 원심하여 전처리공정중 생성된 고형물을 제거하였다. 상층액을 10mM 인산완충액으로 투석시킨 후 Rotofor system을 이용하여 분획하여 정제하였다.

결과 및 토론

SBP 추출정제공정의 각 단계별 효소활성 및 총단백질의 양을 Table 1에 요약하였다.

Table 1. Peroxidase Purification and Recovery Yield Profile

Step	Total Activity (unit)	Total Protein (mg)	Sp. Activity (unit/mg)	Purification Factor ( - )	Yield (%)
crude extract	1875	330	5.7	1	100
salt, pH, thermal treatment	1826	266	6.9	1.2	97
Rotofor feed	1230	15	82.0	14.4	66
Rotofor fraction	1020	4.5	226.7	39.8	54

거대분자물을 제거하기 위한 전처리공정인 염, pH, 열처리는 몇가지 준비실험을 통하여 최적의 수율을 얻는 방법을 택하였다.  염처리에서는 SBP 추출액 50 ml에 효소 안정성을 높여주는 것으로 알려진 CaCl2 1%와 NaCl 1%, K2HPO4 0.5%, (NH4)2SO4 2%를 각각 넣어주고 교반한 후 원심분리시켰다. 응집된 고형물을 제거하고 투석(MWCO 12,000-14,000)시킨 후 활성을 조사한 결과는 다음과 같다. CaCl2만을 첨가했을 때 총단백질당 SBP의 역가인 specific activity는 6.7 unit/ml, NaCl 1%를 첨가했을 경우는 6.5 unit/mg, K2HPO4 0.5%와 (NH4)2SO4 2%를 첨가했을 때는 각각 7.2 unit/mg과 6.8 unit/mg로 CaCl2 1%와 K2HPO4 0.5%를 넣은 추출액의 결과가 가장 좋았다.  pH 처리도 같은 방법으로 비교한 결과 pH 9, pH 10, pH 11의 sp. activity가 각각 6.5 unit/mg, 7.3 unit/mg, 7.9 unit/mg로 나왔다.  또한 SBP의 열안정성이 매우 우수하므로 이를 이용하여 80℃에서 10분간 방치하여 타단백질을 응고시켜 제거하는 처리를 하였다.

Bio-Rad의 Rotofor system을 이용한 결과는 Fig. 1.과 같다.  SBP의 활성은 fraction No. 6-9 (pH 4.2-5.4) 사이에서 보였고 이 부분을 세부분획하여 pH gradient를 pH 2.5에서 pH 5사이로 좁혀 재실험을 해 본 결과 Fig. 2에서 보듯이 SBP의 pI 값은 약 4.2로 추정된다.  이 분획분을 SDS-PAGE로 확인한 결과 SBP의 분자량은 약 45kD로 나타났다.

SBP의 열안정성을 HRP와 비교평가하기 위한 실험을 해보았다.  먼저 Fig. 3은 65℃에서 추출한 SBP와 구입한 HRP의 활성이 어떻게 변화하는가를 관찰한 것으로 HRP가 2시간 안에 50% 이상의 활성을 잃은 반면 SBP는 7시간이 지나도 활성에 거의 변화가 없음을 알 수 있었다.  Fig. 4는 40℃부터 온도를 올리면서 두 peroxidase의 활성을 비교한 것으로 HRP는 50℃부터 활성이 저하되었으나 SBP는 70℃까지 활성이 100% 유지되었다.  70℃에서 HRP는 46%의 활성만이 남았으며 75℃에서는 HRP가 14%만의 활성이 유지된 반면 SBP는 80%의 활성이 유지되었다.

SBP의 pH 안정성을 보기 위하여 pH 3에서 12까지의 활성을 측정해 보았다. Fig. 5에서 보듯이  pH 4와 10 사이의 광범위한 범위에서 활성을 유지함을 볼 수 있었다.

Peroxidase의 과산화수소 분해반응을 알아보기 위하여 32ppm과 71ppm의 과산화수소에 3.2 unit/ml의 SBP (RZ=1.2)와 4.6 unit/ml의 HRP (RZ=0.5)를 넣은 후 시간에 따른 잔존 과산화수소의 양을 측정하였다 (Fig. 6).  3.4 unit/ml SBP의 경우 32ppm과 71ppm의 과산화수소가 20시간 후 각각 약 49%, 45%가 제거되었고, 4.6 unit/ml HRP의 경우 20시간 후 각각 약 30%, 27%가 제거되었다.  따라서 과산화수소의 분해에 있어서는 peroxidase의 활성 자체보다는 효소 내부에 존재하는 heme의 농도를 표시하는 RZ 값이 높은 효소가 그 효과가 큰 것으로 나타났다.

결론

국내 대두피로부터 추출된 SBP의 분자량은 약 45kD이고 pI 값은 4.2로 관찰되었으며, 열안정성 평가 결과 HRP의 경우 65℃에서 7시간후 초기활성의 20%만 남은 반면, SBP는 활성감소가 거의 없었고, 70℃에서는 SBP가 HRP보다 2배 이상의 활성을 유지하고 있었으며 75℃에서는 약 6배 정도의 열안정성을 보였다.  pH 안정성 역시 SBP는 pH 4-10 사이에서 안정함을 나타내었다.  과산화수소의 분해는 두 peroxidase가 비슷한 경향을 보였으나 RZ 값이 높은 SBP가 저농도에서도 더 낮았지만 HRP에 비해 10% 정도 높은 분해능을 보였다.  이같이 안정성이 우수한 SBP는 값 싼 대두피에서 추출할 수 있으며 HRP를 대체할 수 있는 경제적이고 다양한 용도의 peroxidase로 응용될 것으로 기대된다.

참고문헌

1. R. J. Lewis, Sr., "Hawley's Condensed Chemical Dictionary", 12th ed.

(1993).

2. F. S. Burnett, "Peroxidase and its relationship to food flavor and quality: A

review", J. Food Sci., 42, 1-6 (1977).

3. J. P. McEldoon and J. S. Dordick, "Unusual Thermal Stability of Soybean

Peroxidase," Biotechnol. Prog., 12, 555-558 (1996).

4. 서경림, 이은규, □Soybean Peroxidase의 정제 및 특성,□ 한국생물공학회 1997    년도 추계학술발표논문집, pp 69-70 (1997).

5. D. J. Sessa and R. L. Anderson, "Soybean Peroxidases: Purification and

Some Properties", J. Agric. Food Chem. 29, 960-965 (1981).

6. D. F. Bishop, G. Stein, M. Fleischman, and L. S. Marshall., I & EC

Process Design and Development., 7(1), 110-117 (1968).

Fig. 5. SBP activity as a function of pH