Polyacryloylsulfadiazine의 합성과 항균활성(II)

나재운, 전현정, 장미경*

순천대학교 공과대학 고분자공학과, *경상대학교 자연과학대학 화학과

Synthesis and Antimicrobial Activity of

Polyacryloylsulfadiazine(II)

Jae-Woon Nah, Hyun-Jeong Jeon,  Mi-Kyeong Jang*

Dept. of Polym. Sci. & Eng., Sunchon Nat'l Univ., Chonnam 540-742, Korea         *Dept. of Chem., Gyeongsang Nat'l Univ., Gyeongnam 660-701, Korea

서  론

최근의 의약품개발에 관한 연구동향은 약물을 작용발현 부위에 선택적으로 전달시켜 최적의 농도-시간 패턴을 유지하게 하는 의약품의 투여 방법이 최근 큰 관심의 대상이 되고 있다. 현재 사용하고 있는 의약품은 체내에서 용해, 흡수, 전달 과정에서 허용농도 이상 공급됨으로서 오는 부작용은 독성작용까지 유발하게 되며 원하는 장소에 전달되지 못하고 신체 전 부위에 전달되기 때문에 과량의 의약품 투여가 불가피하며, 이로 인한 손실 및 부작용은 막대하다[1,2]. 특히 항생제나 항암제는 암세포와 정상세포의 선택성이 적으므로 기존의 투여 방법을 개선하지 않으면 정상세포의 파괴를 가져올 뿐이다. 고분자에 저분자인 의약을 결합하여 만든 중합체약은 약효와 지속성의 향상이나 안정화, 지연성 등을 목표로 한다.

Hodnett[3]는 중합체의 약효에 관한 연구에서 acrylic acid와 isobutyl vinyl ether의 혼성 중합체가 항종양성을 갖고 있음을 밝혔다. 이 결과에 의하면 polyacrylic acid 자체가 어느 정도의 항종양성을 갖고 있음을 알 수 있다. 최근에 저자 등[4,5]은 cephem계 중합체약인 polyacryloylcephradine과 polyacryloyl-cephalexine을 합성하여 항균력을 시험해 보았으나 단위체 항생물질보다 항균력은 떨어졌으나, 대부분의 Gram 양성균에서는 커다란 감수성을 보여 주었음을 발표했다.

본 연구에서는 이와 관련하여 새로운 항균성 중합체약을 개발하기 위하여 polyacrylic acid와 sulfadiazine을 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide법(이하 DCC법)과 Acid Chloride법으로 polyacryloylsulfadiazine(이하 중합체약)을 합성하였다. 또한 중합체약의 항균활성 효과를 알아보기 위하여 Gram 양성균 5종, Gram 음성균 4종 및 진균 1종에 대하여 항균력 실험을 하였다.

실  험

1. 시약 및 기기

본 실험에 사용한 시약 중  acrylic acid와 N,N'-dicyclohexylcarbodiimide는  Polyscience Ins. 제품을, p-Acetamidobenzenesulfonyl chloride, 2-aminopyrimidine, benzoyl peroxide는 Sigma Chem. Co. 특급시약을 사용하였다. Tetrahydrofuran, toluene, thionyl chloride, pyridine 등의 유기 용매는 Tokyo Kasei Chem. Co. 혹은 Aldrich Chem. Co. 제품을 일반 정제법[6]에 의해 재증류하여 사용하였다. 그리고 미생물 감수성 실험을 위해 사용한 Muller-Hinton agar와 broth는 Difco 제품이었다. 합성한 화합물을 확인하는데 사용한 기기는 FT-IR spectrophotometer(Bruker IFS 66), 1H-NMR spectrometer    (Bruker Sy. 80MHz) 및 DSC(Metter TA-3000)를 사용하였다.

2. 실험방법

Polyacrylic acid와 sulfadiazine은 이미 알려진 방법을 이용하여 합성하였으며, polyacrylic acid의 고유점성도는 최소자승법으로 구했다. 중합체약은 DCC법과 Acid Chloride법으로 합성하였다. 중합체약에 대한 항균력 실험은 각각의 시험균주들을 검정 plate에 접종하여 36.5℃에서 18시간 배양 후 2배씩 단계적으로 희석하였다. 접종한 plate를 일렬로 나열하여 육안으로 관찰하여 성장이 억제된 항균제의 최소발육저지농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)를 정하였다.

3. 항균력 시험

시험균주: Gram 양성균 5종 Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphyloccus aureus IFO 12732, Mycrobacterium phlei IFO 3158, Salmonella typhimurium KCTC 1925, Micrococcus luteus ATCC 9341, Gram 음성균 4종 Escherichia coli BE 1186, Escherichia coli AB 0111, Klebsiella pueumouiae KCTC 1560, Pseudomonas aeruginosa IFO 13130, 진균 1종 Candida albicans IFO 1594를 시험균으로 사용하였다.  Escherichia Coli AB 0111 균주는 Cephamycine C에 고도의 감수성을 갖는 변이주로서 미국 MIT(Dept. of Applied Biological Sciences)의 Dr. A. Demain으로부터 분양받았다. Salmonella typhimurium KCTC 1925 균주는 Penicillin 감수성 변이주이며, Bacillus subtilis ATCC 6633 균주는 Penicillin에 다소간 내성을 갖는 균주이다. Escherichia coli AB 0111을 제외한 9종의 시험균은 KIST 유전공학센타에서 분양받은 균주들이다.

배    지: Brain heart infusion 30g, Peptone 5g, MgSO4·7H2O 1g/□의 조성으로 이루어진 배지를 사용하였으며 고체 평판 배지 제조시에는 Bacto agar 20g을 액체 배지1□에 첨가하였다.

항균활성 측정법: 항균력 실험은 전보[7]와 동일한 방법으로 하였다.

결과 및 토론

p-Acetamidobenzenesulfonyl chloride와 2-aminopyrimidine을 pyridine 중에서 축합시킨 후 6N-HCl로 가수분해하여 수득률 87.2%의 sulfadiazine을 얻었으며 , Cu powder 존재하에 acrylic acid와 1wt%-benzoyl peroxide을 개시제로 사용하여 벤젠중에서  반응시킨 후 잔류 개시제를 제거하기 위해 toluene으로 세척한 다음 원심분리기로 모은 Polyacryl acid의 수득률은 68.4%였으며, 고유점성도가 〔□〕= 0.310으로 구해졌으므로 MHS식에 의해 계산한 점도평균분자량(Mv)은 약 1.6×105daltons이었다.  본 실험에서는 polyacryloyl을 sulfadiazine의 -NH2와 반응시켜서 생성물을 얻는 것이 목적이었으므로 Acid Chloride법 반응을 시도하여 비교적 높은 수득률(74%)로 중합체약을 합성하였으며, 녹는점은 227.5℃(DSC peak)였다. 그러나 DCC법은 반응 생성물의 용해도가 극히 낮은 바, 생성된 dicyclohexylurea를 제거할 때 많은 부분이 생성물과 같이 소실되므로 수득률(24%)이 낮았다.

중합체약에 대한 IR 스펙트럼에 의하면 3450∼3410cm-1에서 -SO2NH와 -COOH의 대칭 신축진동에 의한 흡수띠가 확인 되었다. 그리고 1650cm-1에서 변각진동에 의한 sulfadiazine의 -NH2 흡수띠가 없어지고,  1706cm-1에서 신축진동에 의한 -COOH가 -CONH 의 새로운 특성 흡수띠를 확인 할 수 있었다(Table 1). 1H-NMR 스펙트럼에서는 1.11∼1.75ppm에 나타난 peak는 polyacryloyl(-CH2-CH-)내의 2H에 의해 형성되었고, 2.01∼2.40ppm의 peak는 -CH2-CH-내의 1H에 의해 형성된 것이 관찰되었다. 그리고 1차 아미노기가 2차 아미노기로 되어 6.0ppm 부근에서 proton 1개의  특성  peak가 broad하게 형성된  것으로 보아 중합체약이 합성되었음을 확인 할 수 있었다.

중합체약의 항균력을 검토하기 위하여 Gram 양성균 5종, Gram 음성균 4종 및 진균 1종에 대한 최소발육저지농도를 측정하였다. 중합체약에 대하여 대조물질로 사용된 단일 항균제인 sulfadiazine과 비교하면 항균력은 약하게 나타났다. 그러나 중합체 자체가 항종양성을 가진 polyacrylic acid와 비교하면 Gram 양성균인 Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphyloccus aureus IFO 12732 및 Micrococcus luteus ATCC 9341 균주들에 대해서는 각각 20, 40 및 10□/□의 농도로 균의 발육을 억제하였고, Mycrobacterium phlei IFO 3158과 Salmonella typhimurium KCTC 1925에 대해서는 각각 80□/□의 농도로 유사한 항균성을 보였다. Gram 음성세균인 Klebsiella pueumouiae KCTC 1560의 균주에 대해서는 40□/□의 농도로 균의 발육을 억제하였으나, Escherichia coli BE 1186, Escherichia coli AB 0111 및 Pseudomonas aeruginosa IFO 13130 균주들에 대해서는 각각 80□/□의 농도로 유사한 항균성을 보여주었다. 이러한 결과는 sulfa계의 항균제가 Gram 양성균에 비하여 Gram 음성균에 대한 항균력이 떨어지는 양상과 일치하였다. 한편 sulfadiazine 항균제가 진균류에 대하여 감수성을 보이지 않는 것처럼 Candida albicans IFO 1594에 대해서도 항균력을 나타내지 않았다.

결  론

Polyacrylic acid와 sulfadiazine을 반응시키는 합성법을 검토하였으며 그 중합체약에 대한 항균활성을 측정하였다.

DCC법은 반응 생성물의 용해도가 극히 낮아 생성된 dicyclohexylurea를 제거할 때 많은 부분이 생성물과 같이 소실되므로 수득률(24%)이 낮았다. 본 실험에서는 polyacryloyl을 sulfadiazine의 -NH2에 반응시키는 것이 목적이었으므로 Acid Chloride법 반응을 시도하여 높은 수득률(74%)의 중합체약을 얻었다.

중합체약에 대한 MIC 실험결과 중합체 자체가 항종양성을 가진 polyacrylic acid와 비교하면 Gram 양성균인 Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphyloccus aureus IFO 12732 및 Micrococcus luteus ATCC 9341의 균주들에 대해서는 전반적으로 강한 감수성을 보여주었으나, Gram 음성균인 Escherichia coli BE 1186, Escherichia coli AB 0111 및 Pseudomonas aeruginosa IFO 13130 균주들에 대해서는 유사한 항균성을 보여주었다. 이러한 결과는 sulfa계의 항균제가 Gram 양성균에 비하여 Gram 음성균에 대한 항균력이 떨어지는 양상과 일치하였다. 한편 sulfadiazine 항균제가 진균류에 대하여 감수성을 보이지 않는 것처럼 Candida albicans IFO 1594의 진균에 대해서도 항균력을 나타내지 않았다.

이상과 같이 MIC에서 약효가 유효하다는 점을 감안할 때 본 연구에서 합성된 중합체약은 방출 조절성 제제로서의 이용 가능성을 알 수 있었고, 앞으로 약물 방출 실험과 in vivo 실험을 통하여 고분자 의약품의 성능 평가가 행해져야 할 것으로 사료된다.

참고문헌

1. R. S. Langer and D. L. Wise, □Medical Applications of Controlled         Release□,    Vol.2, 2∼12, CRC Press, Florida(1984).

2. P. Johnson and J. G. Lioyd-Jones, □Drug Delivery Systems□, 7∼28,       Ellis     Horwood Ltd., England(1987).

3. E. M. Hodnett, □Polymers as Antitumor Agents□, Vol.8, 323∼328,         Polymer News(1983).

4. S. I. Kim, W. S. Cha, J. W. Na, Y. H. Kim, and O. H. Ko, J. of the     Chem. Soc., 36, 282(1992).

5. E. K. Yu, K. H. KWun, W. S. Cha, and J. W. Na, J. of the Chem.       Soc., 37, 677(1993).

6. E. R. Blout and R. H. Karlson, J. Am. Chem. Soc., 78, 941(1956).

7. Y. S. Kim, O. H. Ko, and H. R. Kang, Yakhak Hoeji, 34,                120(1990).