□-poly-L-lysine 분리정제를 위한

이온교환크로마토그래피의 수치모사

심승우, 정일안, 선흥석, 박찬영

전남대학교 응용화학부

Simulation of Ion Exchange Chromatography

for Purification of □-poly-L-lysine

Seungwoo Sim, Ilan Cheong, Heungsuk Sun, Chanyoung Park

Faculty of Applied Chemistry, Chonnam National University, Kwangju.

서론

이온교환크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography, IEC)는 단백질, 핵산, 호르몬, 항생물질 등과 같은 고부가가치 생화학물질을 분리 정제하는데 자주 쓰이며, 분석용(analytical scale)뿐만 아니라 실제 분리공정에서도 가장 많이 이용되어지고 있다[1]. 최근 발표된 단백질 분리정제에 관한 문헌 중 75%가 이온교환수지를 이용한 분리정제에 대한 것이었다[2].

크로마토그래피를 사용하여 물질을 분리 시 최적의 조건을 찾아내기 위해서는 많은 실험 데이터가 필요하다. 그러나 분리공정에 대한 수치모사를 수행하여 제한된 조건 하에서 정확히 해석한 다음, 최적의 조건에서 실험적인 접근을 행할 때 많은 실험을 하지 않고도 좋은 결과를 얻을 수 있으므로 수치모사는 크로마토그래피 공정에서 꼭 필요한 과정이라고 할 수 있다.

이온교환크로마토그래피의 수치모사는 Walter[3]가 흡착된 성분과 유체상의 성분 사이에 화학평형관계가 성립된다는 가정 하에 이성분계 크로마토그래피의 흡착과정을 모사하면서부터 본격적으로 이루어지기 시작하였다.

본 연구에서는 식품첨가용 항균물질인 폴리리신(□-poly-L-lysine)을 미생물 배양액으로부터 이온교환크로마토그래피법으로 분리하는 과정을 수치모사하고자 하였다. 이온교환수지와 시료물질사이의 세공확산모델을 적용한 모사식으로 수치모사하고, 이를 실험 데이터와 비교하였다.

이론

본 연구에 사용된 크로마토그래피 칼럼계는 다성분 흡탈착계로 이온교환수지입자 주위를 흐르는 이동상(mobile phase) 물질수지식과 이온교환수지 내의 고정상(stationary phase) 물질수지식으로 이루어진다. 이들 물질수지식을 유도하기 위하여 다음과 같은 가정을 하였다.

·유체속도는 일정하고 플러그(plug)흐름이다.

·충전층의 반경 방향의 농도는 균일하며 이 방향의 확산을 무시한다.

·흡착제는 구형이고 등방성이다.

·경막물질전달계수와 입자내부의 확산계수는 일정하다.

·흡착평형은 Langmuir 등온식에 따른다.

·입자 내부의 물질전달 기구는 확산공정으로 묘사할 수 있다.

1. 시료(sample)의 물질수지식

이동상의 물질수지식 : [eqn: { PARTIAL C_i} over {partial t } + upsilon {partial C_i } over { partial z } -D_L {partial^2 C_i } over {partial z^2 } = - left( {1- epsilon } over epsilon right) left[ 3k_f over R (C_i - C_p,i` |_r=R ) right]]	(1)

초기조건 : [eqn: C_i `( z>0, ~t=0) ``=`` C_p,i`(z>0, ~t=0) ``=`` 0]	(2)

경계조건 : [eqn: D_L {partial C_i } over {partial z } right|_z=0 = - upsilon` (C_i `|_z= _0^- - C_i `|_z= _0^+ )], [eqn: {partial C_i } over {partial z } right| _z=L ``=~ 0]	(3)

고정상 물질수지식 즉, 이온교환수지 내에서의 흡착계는 세공확산 모델에 의해 세공확산 부분과  표면흡착 부분으로 나눌 수 있다.

세공확산 물질수지식 : [eqn: epsilon_p {partial C_p,i } over {partial t} + {partial C_s,i } over {partial t } ``=`` epsilon_p D_p,i ``left( {partial ^2 C_p,i } over {partial r^2 } + 2 over r {partial C_p,i } over {partial r } right )]	(4)

초기조건 : [eqn: C_p,i` ( r,t=0)``=``C_s,i` (r,t=0)``=``0]	(5)

경계조건 : [eqn: {partial C_p,i} over {partial r} right| _r=0 ``=`` 0], [eqn: D_p,i {partial C_p,i } over {partial r} right|_r=R = k_f ` left( C_i - C_p,i` | _r=R right)]	(6)

표면흡착 물질수지식 : [eqn: {partial C_s,i } over {partial t} ``=`` k_1,i` C_p,i` left[ C_T - SUM from { {i }=1} to n C_s,i right] - k_2,i` C_s,i]	(7)

2. 용출완충액(elution buffer)의 물질수지식

이동상의 물질수지식: [eqn: { PARTIAL C_b,j} over {partial t } + upsilon {partial C_b,j } over { partial z } -D_L {partial^2 C_b,j } over {partial z^2 } = - left( {1- epsilon } over epsilon right) left[ 3k_f over R (C_b,j - C_bp,j` |_r=R ) right]]	(8)

초기조건 : [eqn: C_b,j `( z>0, ~t=0) ``=`` C_bp,j`(z>0, ~t=0) ``=`` C_b0,j]	(9)

경계조건 : [eqn: D_L {partial C_b,j } over {partial z } right|_z=0 = - upsilon` (C_b,j `|_z= _0^- - C_b,j `|_z= _0^+ )], [eqn: {partial C_b,j } over {partial z } right| _z=L ``=~ 0]	(10)

세공확산 물질수지식 : [eqn: epsilon_p {partial C_bp,j } over {partial t} + {partial C_bs,j } over {partial t } ``=`` epsilon_p D_bp,i ``left( {partial ^2 C_bp,j } over {partial r^2 } + 2 over r {partial C_bp,j } over {partial r } right )]	(11)

초기조건 : [eqn: C_bp,j` ( r,t=0)``=``C_b0,j]	(12)

경계조건 : [eqn: {partial C_bp,j} over {partial r} right| _r=0 ``=`` 0], [eqn: D_p,j {partial C_bp,j } over {partial r} right|_r=R = k_f ` left( C_b,j - C_bp,j` | _r=R right)]	(13)

표면흡착 물질수지식 : [eqn: {partial C_bs,j } over {partial t} ``=`` k_b1,i` C_p,i` left[ C_T - SUM from { {i }=1} to n C_bs,j right] - k_b2,i` C_bs,j]	(14)

위에서 언급된 (1)∼(14)식을 무차원화시킨 후 FDM 수치해석법을 적용하여 음함수 Euler법으로 풀이하였다.

실험

실험에 사용한 크로마토그래피 장치(HPLC, Vintage 200 series, Orom Tech, Kores)는 펌프와 자외선 분광광도계(UV detector)로 구성되어있다. 또한 다량의 시료주입을 위한 시료주입기(sample injector)를 외부에 설치하였으며, 분광광도계의 출력을 연속적으로 컴퓨터로 기록하였다. 칼럼은 직경 10□, 길이 20□인 이온교환 크로마토그래피용 유리컬럼을, 이온교환수지는 CM-Sepharose Fast Flow(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)를 사용하였다.

분리용 시료는 선 등[4]이 배양한 St. albulus의 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 한외여과한 농축 배양액을 사용하였다. 완충액은 50mM Tris-HCl(pH 8.5)을 사용하였다. 칼럼에서 분리되어 나온 용출액 내의 단백질양은 흐름식 UV셀에 통과시켜 220□의 흡광도로 연속 측정하여 결정하였다.

결과 및 고찰

1. 매개변수 추정

본 모델식에서 사용되는 매개변수는 실험장치로부터 얻어지는 변수와 실험을 통하여 얻어야 하는 변수로 구분된다. 실험장치로부터 얻어지는 변수에는 유속, 칼럼의 내경, 칼럼의 길이, 수지입자의 반경이 있고, 실험을 통하여 얻어지는 변수에는 확산계수, 공극률, 수지입자 내 확산계수, 경막물질전달계수, 흡탈착속도상수가 있다. 실험적으로 얻어지는 변수는 파과곡선과 평형흡착량곡선의 실험 데이터에 시행오차 계산법으로 예측 결과를 최적화시켜 추정하였다.

추정된 매개변수들 중 확산계수와 수지입자 내 확산계수는 피크(peak)의 너비에, 흡탈착속도상수는 용출시간에 영향을 미침을 알 수 있었다.

2. 폴리리신 평형흡착량 측정

칼럼의 이온교환수지 내 폴리리신의 평형흡착량을 측정하고자 하였다. 펌프와 분광광도계를 직접 연결하고 분광광도계와 펌프사이에 마개가 없는 작은 칼럼을 설치하여 시료를 배출시키지 않고 순환시키면서 평형흡착량을 측정하였다. 그  결과가  Fig. 1에 나타나있다.

Fig. 1을 통해 폴리리신이 이온교환수지에 Langmuir 등온흡착 형태로 흡착됨을 알 수 있었으며, 수지 1□당 흡착되는 폴리리신 최대 흡착량(53.03□)을 구할 수 있었다. 이를 통해 본 계를 모사하는데 있어서 Langmuir 등온흡착 모델이 적합함을 알 수 있었다.

3. 선형전개에 의한 □-폴리리신 분리 모사

제안된 수치모사식을 이용한 예측 결과가 실험 데이터와 일치하는지 비교해 보았다. 실험 데이터는 농축 배양액 20□를 injector로 주입 후 분당 1□의 유속으로 염(salt) 농도를 선형 전개하여 각 성분의 용출시간(elution time)을 측정하여 얻었다. 실험은 완충용액과 수지가 충분히 평형화된 칼럼에 시료를 주입하고 수지에 미 흡착된 성분이 칼럼에서 완전히 용출되는 10∼15분 경과 후 선형전개를 실시하였다.

예비실험으로부터 추정된 매개변수들을 무차원화된 (1)∼(14)식에 대입하여 폴리리신의 분리를 예측한 결과 Fig. 2에서처럼 실험 데이터와 잘 일치하였다. 이온교환크로마토그래피에서 선형전개에 의한 폴리리신 분리는 제안된 모사식으로 잘 모사할 수 있었다.

결론

본 연구에서는 이온교환크로마토그래피를 이용한 □-폴리리신의 분리를 수치적으로 모사하고자 하였다. 흡착계 이온교환수지 내 세공확산 이론을 근거로 모사식을 유도하고, 예비실험 데이터로부터 매개변수들을 추정하였다. 추정된 매개변수를 모사식에 적용하여 폴리리신의 분리를 예측한 결과 실험 데이터와 잘 일치하다. 제안된 수치모사식을 이용하여 이온교환크로마토그래피에 의한 폴리리신 분리의 용출시간을 예측할 수 있었다.

참고문헌

1. Belter, P. A., Cussler, E. L. and Hu, W. S, "Bioseparations : Downstream Processing for Biotechnology", John Wiley & Sons, New York, USA.(1988).

2. Bonnerjera, J., Oh, S., Hoare, M. and Dunhill, P, Biotechnology, 4, 954(1986).

3. Walter, J. E., J. Chem. Phys., 13. 229(1945).

4. Sun, H. S., Park, Y. P., J. Korea Soc. Ins. App., 2(1), 91(1999).

Fig. . Simulation results and experimental data of isocratic elution chromatogram for broth under the 0.4 NaCl mole concentration.

Fig. 1. Adsorption isotherm of the □- Poly-L-lysine to the CM-Sepharose FF.