역상미셀을 이용한 BSA의 액-액 추출에 관한 연구

이은주,  김종화*, 전성균**, 이성식

동아대학교 화학공학과

창원대학교 공업화학과*

양산대학 산업안전과**

Liquid-Liquid Extraction of BSA with Reversed Micelles

Eun-Joo LEE, Jong-Hwa KIM*, Sung-Gyun JEON**, Sung-Sik LEE

Department of Chemical Engineering. Dong-A University

Department of Chem. Tech., Changwon National University*

Department of Industrial Safety, Yang-San College**

1. 서 론

역상미셀은 분리 또는 반응에 용매추출법의 장점을 가지면서 막대한 계면과 얇은 액막으로 반응 표면적이 크기 때문에 추출속도가 매우 빠른 장점을 가지고 있다. 그리고 내부 조직에 물질의 출입이 쉽게 진행되므로 물질분리나 화학반응에서 중요한 기능적 구조 유체의 일종이라 볼 수 있다.  역미셀로의 단백질 분리는 단백질-미셀간의 화학적 입체구조, 정전기적 상호작용 그리고 소수적 상호작용에 지배된다. 이러한 인자들을 조절하여 단백질-미셀간의 추출율의 변화가 일어난다. 이와같이 역상미셀은 분리나 반응의 특이한 장을 제공하므로 응용연구가 여러방면에 진행중이며 특히 단백질의 추출분리에 관하여 많은 연구가 진행중이다. 본연구는 AOT역상미셀을 이용하여 BSA를 수상에서 유기상으로 정추출 그리고 유기상에서 수상으로 역추출 실험하여 분리특성을 조사하였으며 또한 알콜의 첨가가 BSA의 역추출에 미치는 영향을 실험조사하였다.

2. 실 험

2.1. 시 약

실험에 사용한 음이온계면활성제는 sodium di[2-ethylhexyl] sulfosuccinate로 Tokyo Kasei Co.제를 정제없이 그대로 사용하였다. Bovine serium albumin(BSA, pI=4.9)는 Sigma Chemical Co.사제를 사용하였고, EtOH, BuOH, HexOH 그리고 OctOH는 Junsei Co.사 특급시약을 사용하였으며, 실험에 사용된 완충용액의 pH는 범위가 1.10∼3.50는 0.1N HCl - 0.1N Glycine, 4.96∼6.69는 0.1N NaOH - 1/100M NaH2C6H5O7, 8.53∼12.90는 0.1N NaOH - 0.1N Glycine의 완충용액를 각각 이용하여 조절하였다.

2.2. 실험방법

수상으로부터 유기상으로 정추출, 유기상에서 수상으로 역추출분리 시험은 Figure1과 같이 수상과 유기상의 계면을 유지하면서 두상을 교반시키는 Phase transfer법을 사용하였다.  위쪽에 있는 유기상은 교반기에 연결된 회전날개를 이용하여 교반시켰고, 아래쪽의 수상은 자석교반기를 이용해 교반시켰다.  반응기는 지름이 8cm이고 높이가 10cm인 유리제품으로 그 내부에 효과적인 교반을 하기 위해 4개의 날개가 달린 방해판(baffle plates)을 설치하였다. 실험온도는 반응기에 항온조를 연결하여 25±1℃로 일정하게 유지하였다.

Fig. 1. Details of phase transfer reactors

A: Organic phase sampling  B: Jacket  C: Water inlet  D: Organic phase

E: Aqueous phase  F: Magnetic bar   G: Magnetic stirrer H: Water outlet

역추출(back extraction) 실험은 반응기에 0.1M KCl을 가하여 pH를 조절한 수상을 100cm3 채운 후 유기상(100mM AOT/isooctane) 100 cm3에 마그네틱 바를 넣고 강하게 교반하면서, 0.1ml 마이크로피펫을 사용하여 10회에 걸쳐 10mg/ml의 BSA를 가하여 유기상이 맑아질 때까지 교반하고, 여기에 각 알콜의 종류와 농도를 바꾸어 가면서 이 두상(수상과 유기상)을 계면이 깨지거나 섞이지 않도록 조용히 그리고 아주 천천히 주입하여 두 개의 상을 유지한 채 두상을 60rpm으로 각각 같은 방향으로 교반시키면서 유기상에서 수상으로 상간 이동시켰다. 이때 시간의 변화에 따라 수상의 BSA 농도 변화를 측정하였다. BSA의 농도측정은 280nm에서 UV(자외선 분광 광도계)를 사용하였다.

3. 결과 및 고찰

AOT 역상미셀을 이용하여 BSA의 정추출 및 역추출 속도에 대하여 Phase transfer법으로 실험하였다. Figure2은 수상의 pH변화에 따른 BSA의 정추출 속도에 관한 실험결과이다. 수상의 pH가 중성으로 갈수록 추출분배율과와 추출속도가 감소 함을 알 수 있다. 그러나 pH가 3부근에서는 추출율이 거의 100%이며, 추출속도도 크게 증가 되었다. Figure3은 유기상에서 수상으로 역추출시 strip액의 pH변화에 따른 역추출율과 역추출 속도에 대한 결과이다. stip액의 pH가 알카리영역에서는 역추출 효과가 비교적 양호 하였으나 pH가 3.7에서는  역추출 효과가 극히 저조 함을 알 수 있다. 한편 Figure4, 5는 역상미셀에  에탄올과 부탄올을 각각 첨가하였을 때 strip액의 pH가 3.7에서 BSA의 역추출 속도 실험 결과이다. 유기상에 에탄올의 첨가가 BSA의 역추출율과 역추출속도를 아주 크게 증가시킴을 알 수 있다. 그러나 첨가한 에탄올의 농도는 0.2vol.%에서 역추출 속도가 최대였다.

Fig.2 Forward extraction rate of BSA    with AOT reverse micelles

(Cini:1mg/ml)

Fig.3 Effect of pH strip liquor on           back extraction rate of BSA

Fig.4 Effect of addition of ethanol on

back extraction of BSA with AOT

reverse micelles

Fig.5. Effect of addition of butanol

on back extraction of BSA

with AOT reverse micelles

4. 결 론

1. AOT/iso-Octane계로 조제한 역상미셀을 이용하여 Phase Transfer법으로         BSA 추출분리시 수상의 pH가 등전점인 pH4.9 이하에서 추출속도 및 추       출율이 급격히 증가하였다.

2. 유기상에서 수상으로 BSA의 역추출은 정추출율에 비하여 아주 낮았으며,       Strip liquor의 pH값이 산성영역에서는 역추출이 효율이 저조하였다.

3. AOT/iso-Octane 유기상에 일정농도 (0.2vol.%) 에탄올을 첨가한 경우에         BSA의 역추출율과 역추출속도는 크게 증가 하였다.

5. 참고문헌

1) Kuboi, R., Hong, D.-P., Komasawa, I., Shiomori, K., Kawano, Y. and Lee,          S.-S., 'Effect of Proteins Solubilized into AOT Reverse Micelles on Their           Back-extraction and Percolation Processes" , Solv. Extr. Res. Dev. Japan, 3, 223       (1996)

2) Yasushi Yamada, Ryoichi Kuboi and Isao Komasawa, "Extraction of Enzymes        and their Activities in AOT Reverse Micellar Systems Modified with Nonionic       Surfactants", Journal of Chem. Eng. of Japan, Vol.27 No.3 (1994)

3) Kelly, B., Wang, D.C. and Hatton, T.A., "Affinity Based Reverse Micellar           Protein  Extraction. Ⅱ. Effect of Cosurfactant Tail Length", Biotechnol. Bioeng.,       42, 1199 (1993)

4) Holovko, M. and Badiadi, J.P., "Effect of an Association Potential on               Percolation.  Application to Reverse Micelles Containing Proteins", Chem. Phys.       Letters, 204, 511 (1993)

5) Hong, D.-P., Kuboi, R., Komasawa, I., "Extraction of Proteins and Polymers         Using Reverse Micelles and Percolation Process", Korean J. of Chem., 14(5),        334-340 (1997)