RP-HPLC에서 이동상의 조성과 Buffer의 농도에 따른

체류인자의 예측

이 주 원, 노 경 호

인하대학교 화학공학과

Prediction of Retention Factor as a Function of Buffer Concentration and Mobile Phase Composition in RP-HPLC

Ju Weon Lee, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University

1. 서론

분석기기용으로 널리 이용되는 크로마토그래피가 상업적 규모로 응용되려는 시도는 오래 전부터 있어 왔으나 유전 및 생명공학에 의한 제품들에 대한 분리, 정제의 방법으로서 연구 및 산업화가 급속히 진행중이다. 최근에 크로마토그래피는 천연물, 세포배양, 또는 합성 후에 고부가가치의 특정성분을 고순도로 분리하기 위해서 주로 이용된다.

RNA를 포함하는 수용액을 5'-phosphodiesterase enzyme 과 같이 배양을 하면 네 가지 5'-nucleotides인 5'-Guanosine monophosphate(5'-GMP), 5'-Uridine monophosphate(5'-UMP), 5'-Cytidine monophosphate(5'-CMP), 5'-Adenosine monophosphate(5'-AMP) 가 형성된다. 이중에서 5'-GMP만이 향미제로 쓰이고 있다. 또한 5'-AMP는 향미제로 쓰이는 5'-Inosine monophosphate(5'-IMP), 의 전구체로 쓰이고 있다[1].

역상 고성능 액체크로마토그래피 (RP-HPLC)는 최근에 가장 많이 쓰이는 분석 기기로써, 이온성 물질을 분리하고 분석하기 위해 일반적인 이동상에 염(salt), 산, 염기와 같은 이온성 물질을 첨가하여 분리하는 기술(Ion-pair liquid chromatography)이 도입되고 있다. 이온성 물질은 물에서 이온으로 존재한다. 이 이온들은 강한 극성을 가지고 있기 때문에 C18기를 가지고 있는 비극성 고정상에는 체류하지 않기 때문에 분리하기가 어렵다. 이러한 이온성 물질을 RP-HPLC에서 분리하기 위해서는 분리하는 물질보다 이온세기가 큰 물질을 이동상에 첨가하여 분리하고자 하는 물질의 이온화 경향을 줄여 이온화되지 않은 물질을 고정상에 체류하게 하여 체류시간을 증가시켜 분리한다. 본 연구의 목적은 이동상의 조성과 buffer의 농도에 따라 체류인자를 예측하여 최적 분리조건을 얻는 것이다[2].

2. 이론

이온성 물질의 체류는 이온으로 존재할 때와 이온이 아닌 물질로 존재할 때에 대해서 각각의 체류인자의 합으로 나타낼 수 있다. 물질이 약산인 경우에 대해서 고려하면 위의 그림과 같이 HA와 A-로 존재할 경우의 체류인자의 합과 같으며 다음과 같이 표시할 수 있다.

[eqn: k = k_HA F_HA + k_A- ( 1-F_HA )]	(1)

k는 전체의 체류인자, kHA는 HA로 존재할 때의 체류인자, kA-는 A-로 존재할 때의 체류인자이며, FHA는 이동상 중에 HA로 존재하는 mole fraction이다. 식 (1)을 HA의 이온화 상수 Ka로 표현을 하면 다음과 같다[2-4].

[eqn: k = {k_HA + k_A- K_a / [H^+ ]} over {1 + K_a / [H^+ ]}]	(2)

위의 식은 Ka, kHA, kA-의 세 개의 parameter로 표현된다. 식 (2)는 이동상의 pH값에 따른 물질의 체류인자의 변화를 나타낸다.

[eqn: k = {A + B cdotF_Buffer} over {1 + C cdot F_Buffer}]	(3)

식 (3)은 buffer의 농도에 따른 체류인자의 변화를 표시한 실험식이다. A, B, C는 실험상수이며 FBuffer는 이동상 내에 buffer의 농도이다.

3. 실험

본 실험에서 사용된 nucleotide는 Cytidine-5-monophosphate Disodium salt (CMP), Uridine-5- monophosphate Disodium salt (UMP), Guanosine-5- monophosphate Disodium salt (GMP), Inosine-5- monophosphate Disodium salt (IMP), Adenosine-5- monophosphate Disodium salt (AMP)로 Fluka에서 구입하였으며 이동상으로 쓰인 water는 증류장치로 증류하여 ULTRA-PURE WATER SYSTEM Milli-Q50 (Millipore)를 이용하여 18□cm의 초순수를 만들어 사용하였으며 methanol은 HPLC-grade를 J. T. Baker에서 구입하여 사용하였다. 이동상의 pH를 조절하기 위해서 사용된 세 가지 buffer는 Acetic acid, Sodium phosphate, Ammonium acetate이다. HPLC column은 0.3930cm의 empty column에 Lichrospher 100 RP-18 (15m, MERCK) packing을 충진하여 사용하였다. 시료는 100ppm의 수용액으로 만들어 주입하였고 이동상의 유속은 1ml/min으로 고정하였다. UV wavelength는 254nm로 고정하여 실험하였다.

4. 결과 및 고찰

Fig. 1은 buffer의 농도에 따른 체류인자의 변화를 보이고 있다. buffer의 양이 증가할수록 체류인자는 증가하다가 일정량 이상의 buffer의 농도에서는 체류인자의 변화가 없이 일정한 값을 보이고 있다. 그 이유는 시료가 가질 수 있는 최대의 체류인자의 크기 이상으로 증가할 수 없기 때문으로 보인다. 역상인 경우 이온으로 존재할 때에는 비극성 고정상에 거의 흡착하지 않고 비이온으로 존재할 경우에만 흡착하기 때문에 buffer의 농도가 증가할수록 비이온의 체류인자에 접근하기 때문에 비이온의 체류인자보다 크게 나오지 않기 때문이다. Fig. 2는 식 (3)으로 예측한 체류시간과 실험으로 구한 체류시간을 서로 비교한 것으로 서로 잘 일치하고 있다(r2 = 0.9998).

참고문헌

[1] T. Nagodawithana, Food Technology, 138 (1992).

[2] M.W. Hajnos, J. Chromatogr. B, 717 (1998).

[3] C. Horvath, W. Melander, I. Molnar, Anal. Chem., 49 (1977).

[4] S.N. Deming, M.L.H. Turoff, Anal. Chem., 50 (1978).

Fig. 1 Retention factor with concentration of acetic acid

Fig. 2 Comparison of calculated retention factor and experimental retention factor