Papain으로 처리된 Cellulase를 이용한 고급폐지의 탈묵

류근갑*, 배준상*, 이상목**, 구윤모**

*: 울산대학교 화학공학부    **: 인하대학교 공과대학 생물공학과

Deinking of Laser-Printed Paper with Papain-Treated Cellulase

Keun-Garp Ryu*, Jun-Sang Bae*, Sang-Mok Lee**, Yoon-Mo Koo**

*: School of Chemical Engineering, Ulsan University

**: Department of Biological Engineering, Inha University

서  론

Cellulase는 불용성 고분자 물질인 cellulose를 glucose, cellobiose 및 저분자 용해성 cellulose로 분해하며 주로 박테리아와 fungi로 부터 생산되고 있다[1, 2]. 이러한 cellulase를 이용하여 풍부한 자연자원인 cellulose로부터 에탄올 등과 같은 유용한 물질을 생산하기 위한 방법이 연구되어 왔으며 [3] 최근에는 폐지재생공정에서 섬유의 탈수성 개선, 재생펄프의 물성 향상 및 탈묵효율의 증가등을 위해서 cellulase를 이용하는 방법이 연구되고 있다[4, 5]. 특히 cellulase를 이용한 탈묵방법은 기존의 물리화학적 탈묵방법에 비하여 화학물질의 사용량을 감소시킴으로서 오염물질의 배출량을 줄이고, 기계적 마찰정도를 줄여 재생펄프의 물성을 향상시킴으로서 펄프의 재사용 횟수를 증가시켜서 천연펄프를 제조할때 초래되는 산림자원의 훼손을 줄이는등 환경문제의 해결에 매우 중요한 역할을 하게될 것으로 기대되고 있다.

하나의 생물체는 여러종류의 cellulase를 동시에 생산하는 것으로 알려져 있다. 순수한 형태의 cellulase는 cellulose에의 흡착성, 기질선택성 및 분자특성(분자량, pI, 아미노산 구성등)이 서로 다르다. 이들 cellulase들은 반응특성에 따라서 비결정성 cellulose 사슬의 중간을 무작위로 분해하는 endo-1,4-□-glucanases (endoglucanases), 결정형 cellulose에 흡착하여 cellulose chain의 끝부분을 glucose 또는 cellobiose로 분해하는  exo-1,4-□-glucanases (exoglucanases 또는 cellobiohydrolases)로 분류되고 있으며 cellobiose를 glucose로 분해하는 □-glucosidases (cellobiase) 도 함께 생산된다[6]. Cellulase를 생산하기 위해서 주로 사용되고 있는 Trichoderma viride 및 Trichoderma reesei 등은 2-3종류의 exoglucanase와 5종류 이상의 endoglucanase를 생산하는 것으로 알려져 있다[7]. 상업용 cellulase들은 대부분 여러종류의 cellulase가 혼합되어 있는 조효소 형태로 개발되어 있다.  그러나 폐지재생공정에 이들 상업용 조효소를 이용할 경우 조효소에 포함되어 있는 exoglucanase와 endoglucanase사이의 synergism효과에 의해서 결정형 cellulose인 펄프가 분해되는 것으로 알려져 있다. 따라서 cellulase에 의한 펄프의 분해를 최소화 하는 동시에 탈묵효과를 높일 수 있는  효소의 개발이 필요하다. 김 등은 Trichoderma viride로부터 정제된 endoglucanase 및 exoglucanase를 재생펄프의 탈묵에 이용할 경우 이들 순수 cellulase들의 혼합비율에 따라서 탈묵펄프의 백색도 및 물리적 강도가 변화함을 보였으며 탈묵공정의 효율성을 향상시키기 위해서는 exoglucanase의 활성을 억제할 필요성이 있다고 했다[8]. 또한 박 등은 고분자인 polyoxyethylene을 부착시킨 cellulase를 이용하여 폐지를 탈묵하면 재생펄프의 물성이 향상되었다고 보고하였다[9].

한편 Trichoderma reesei가 생산한 exoglucanase인 cellobiohydrolase의 구조는 catalytic domain과 cellulose 흡착 domain으로 이루어져 있으며 이들 domain의 연결 부위는 papain에 의해서 절단될 수 있는 것으로 알려졌다 [10]. 또한 papain에 의해서 binding domain이 제거된 cellulase는 microcrystalline cellulose(Avicel) 분해활성이 줄었으나 용해성 cellulose의 분해활성은 감소하지 않았다고 보고되었다[11]. 본 연구에서는 Trichoderma reesei Rut C-30에 의해서 생산된 cellulase 조효소 (crude enzyme) 를 papain과 반응시킨 후 CMC 및 Avicel분해활성의 변화를 연구하였고 또한 고급폐지 탈묵에 미치는 영향을 연구하였다.

실험 재료 및 방법

본실험에서 사용한 조효소는 Trichoderma reesei Rut C-30 배양액에 ammonium sulfate를 65%(w/v) 첨가한 후 생성된 침전물을 ultrafiltration membrane (PM-10, Amicon)을 이용해서 증류수로 dialysis하고 나서 동결건조하여 얻었다. 미생물의 배양방법 및 고급폐지의 탈묵방법, 재생펄프의 물성측정방법은 한 등의 방법과 같다 (12).

Cellulase에 의한 CMC 및 Avicel의 분해활성은 효소반응에 의해서 생성된 환원당을 dinitrosalicylic acid (DNS)방법을 이용하여 측정했으며 구체적인 방법은 다음과 같다 (Wood and Bhat).  CMC 또는 Avicel을 1% (w/v)포함하고 있는 용액 (100 mM sodium acetate, pH 5.0) 2 mL에 효소액 20 □L를 가하고 50℃에서 각각 30분간 또는 120분간 반응시킨 후 냉각시켰다. 냉각된 반응액 0.25 mL를 취하여 DNS 시약 1.5 mL 및 glucose 표준용액 (20% w/v) 0.5 mL와 혼합하여 100℃에서 5분간 반응시키고 즉시 냉각한 후 540 nm에서의 용액의 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성은 1분간 1 □mole의 환원당을 생성할 때 1 unit으로 정의했으며 표준곡선은 glucose를 이용해서 구했다.

결과 및 토론

여러가지 단백질 분해효소에 의한 조효소 처리

여러종류의 단백질분해효소를 Cellulase 조효소와 혼합한 후 (무게비 1:1) 4oC에서 24시간 동안 반응시켰을 경우 papain의 경우 Avicel활성을 선택적으로 저해하였으며 다른 단백질 분해효소(chymopapain, subtilisin carlsberg, chymotrypsin, thermolysin)등은 Avicel 분해활성과 CMC 분해활성을 동시에 감소시켰다.

Papain 사용량 및 반응온도 영향

Cellulase 조효소와 Papain의 반응온도를 4, 30, 50, 60oC로 변화시키고 Papain의 사용량을 Cellulase 조효소에 대한 무게비로 0.01-1까지 변화시켰을 경우 ( 반응시간은 24시간) CMC 분해활성/Avicel 분해활성 비율은 조효소의 경우 약 19에서 60oC반응에서 약 250배까지 증가하였다. 이때 CMC분해활성은 거의 감소하지 않았다. 따라서 Cellulase 조효소와 Papain을 반응시키면 선택적으로 Avicel 분해활성을 감소시킬 수 있었다. 반응온도를 70oC 로 증가시키면 Cellulase 활성은 모두 저해되었다. 반응시간은 3시간내에 Papain과의 반응이 완료되는 것을 알아내었다. 또한  Papain의 사용량은 Cellulase 조효소의 0.1배를 사용하면 충분한 반응효과가 있었다

Papain처리 된 Cellulase를 이용한 폐지재생실험

위의 연구 결과를 이용해서 CMC 분해활성/Avicel 분해활성 비율이 원래의 19배에서 60배 (30oC, 24시간 반응)와 130배 (50oC, 24시간 반응)로 증가된 효소를 만든 후 이 효소를 이용해서 폐지재생실험을 한 결과 원래의 효소를 사용했을 경우에 비해서 탈묵도, 여수도, 종이강도, 수율등이 증가하였다 (Table 1)

결   론

Trichoderma reesei Rut C-30의 배양에 의해서 생산된 cellulase를 papain과 반응시키면, 비결정형 cellulose인 carboxymethyl cellulose (CMC) 의 분해활성은 변하지 않았으나 결정형 cellulose인 Avicel 분해활성은 감소하였다. Papain과 반응한 cellulose를 이용해서 고급폐지인 laser-printed paper를 탈묵시켰을 경우 원래의 cellulase를 사용했을 경우에 비해서 펄프수율 및 재생펄프의 강도가 증가하였다.

참고문헌

1. Beldman, G., A. G. J. Voragen, F. M. Rombouts, M. F. Searle-van        Leeuwen, and W. Pilnik: Biotechnol. Bioeng., 30, 251(1987).

2. Wood, W. A. and S. T. Kellogg, eds (1988). Biomass Part A Cellulose     and Hemicellulose. Methods Enzymol., Vol. 160. Acedemic Press.

3. Trotter, P. C.: Tappi J., 73(5), 201(1990).

4. Stork, G. H. Pereira, T. M. Wood, E. M. Dusterhoft, A. Toft, and J.      Puls: Tappi J., 78(2), 79(1995).

5. Jeffries, T. W. J. H. Klungness, M. S. Sykes, and K. R.

Rutledge-Cropsey: Tappi J., 77(4), 173(1994).

6. Klyosov, A. A.: Biochem., 29(47), 10577(1990).

7. Kim, D. W., Y K. Jeong, Y. H. Jang, and J. K. Lee: J. Fermen. Bioeng.,

77(4), 363(1994).

8. 김동원, 정영규, 장영훈, 손기향: 한국생물공학회지, 11(6), 718(1996).

9. 박진원, 박귀남, 이주한, 이병준: 한국생물공학회지, 13(5), 593(1998).

10. Teeri, T.T., Reinikainen, T., Ruohonen, L., Jones, T.A., Knowles,

J.K.C.: J. Biotechnol., 24, 169(1992).

11. Tomme, P., H. Van Tilbeurgh, G. Pettersson, J. Van Damme, J.

Vandekerckhove, J. Knowles, T. Teeri, and M. Claeyssens: Eur. J.

Biochem., 170, 575(1988).

12. 한우석, 구윤모: 화학공학, 36(5), 759(1998).

Table 1. Deinking efficiency and physical properties of recycled pulp using crude cellulase or papain treated cellulase.

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Crude	Papain-treated    Papain-treated

cellulase	cellulase (I)	cellulase (II)

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CMC/Avicel*	19	60	130

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Pulp yield(%)	83.09	84.56	85.16

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Brightness	81.21	81.19	81.39

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Freeness (mL)	595	600	577.5

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Burst Index	2.084	2.126	2.089

(KPa·m2/g)

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Tear Index	5.874	6.086	6.190

(mN·m2/g)

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Tensile strength	39.80	39.860	39.69

(N·m/g)

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*: Activity ratio

Data are the averages of seven data points.