유기용매중 페니실린 아실라제의 반응성에 대한 이론적 해석

김성재*, 윤병준

포항공과대학교 화학공학과

Theoretical Analysis of Enzyme Catalytic Reaction

with Penicillin acylase in Organic Cosolvent

S. J. Kim*, B. J. Yoon

Department of Chemical Engineering, POSTECH

서  론

단백질을 촉매로 이용하는 생체 반응 시스템에서 반응조건으로 물 이외의 유기 용매를 사용하면 가수분해를 억제하고 물의 활성도를 변화시켜 반응 속도를 향상시키고 수율을 높일 것으로 예상되었다. 그러나 실제 실험에서는 오히려 반응속도와 수율이 모두 낮아지는 현상을 보인다. 이러한 현상을 단백질 구조와 유기용매하에서 단백질 성질의 변화를 고찰하여 설명하여보았다. 이로써 결합 에너지와 반응속도 등을 넣어준 유기용매의 유전상수와 관계지어 이론적으로 예측을 할 수 있게되었다. 본 연구의 시스템은 D-□-phenylglycine methyl ester(PGM)과 pivaloyloxymethyl 6-aminopenicillanic acid(POM-6-APA)를 penicillin acylase(PA) 촉매를 이용하며 pivampicillin(PVM)으로 합성하는 것이다.

이  론

단백질의 residual들 중에서 Tyr, Cys, Asp, Glu, Thr과 carboxylic acid는 pH가 pK보다 클 때 음전하를 띄게 되고, His, Arg, Lys과 amino acid는 pH가 pK보다 작을 때 양전위를 띄게 된다. 그러므로 주어진 시스템의 pH에서 pKa값을 알면 Henderson-Hasselbalch equation을 이용하여  PA의 부분 전위를 작성할 수 있다.

[eqn: pH=pKa+log { [A^- ] } over { [HA] }]

()

물에서의 pKa값들은 이미 실험적으로 모두 구해졌다. 그러나 residual 하나를 순수 유기용매에 넣어서 실험을 하게되면 단백질 구조 변성의 이유 등으로 실험이 불가능하여 실험치 들은 알려져있지 않다. 그러나 이론적으로 Nernst equation을 이용하여 유기용매로의 용해 에너지(solvation energy) 차이를 알면 유기용매하에서의 각 residual의 pKa값들을 알 수 있다.

[eqn: triangle G_solv ^{R^protonate } -triangle G_solv ^ R = 2.303 R T ( pH - pKa)]

()

좌변의 R은 residual의 일반적 형태이고 Rprotonate는 residual이 전위를 띄는 형태이다. 우변의 R은 기체상수이고 T는 실험온도(실온)이다. 용해 에너지(△GR)는 한 분자가 진공에서 용매로 전달될 때의 에너지 차이로 용매가 물이 되면 수화에너지가 된다.

[eqn: triangle G_solv =triangle G_vacuum - triangle G_solvent]

()

용해 에너지를 결정하는 가장 중요한 요소는 용매의 유전상수이다. 이것은 수치해석을 통하여 계산할 때도 중요한 변수로써 작용한다.  용해 에너지와 단백질 주위의 potential 분포는 경계요소법(BEM)의 수치해석 방법을 통하여 구할 수 있다.  단백질의 구조는 Brookhaven의 protein data bank에서 얻고 Connolly의 Molecular surface package를 이용하여 단백질 표면을 삼각형 요소로 이산시켜 계산한다.

fig. Penicillin acylase.

fig. Discretized surface of PA.

계를 무한 용매 속에 담겨있는 단백질 분자로 하면 지배방정식과 경계조건은 다음과 같다.

(지배방정식)

[eqn: inside~of~molecule~&:~nabla^2 phi^i = - 1 over epsilon^i SUM from {k=1} to {n} q_k ``delta( bold x - {bold x}_k ) #outside~of~molecule~&:~nabla^2 phi^e = kappa^2 phi^e]

()

(경계조건)

[eqn: phi^i &= phi^e ~~~~~~~at~"inter"face# epsilon^i {partial phi^i } over { partial bold n } &= epsilon^e {partial phi^e } over { partial bold n }~~at~"inter"face#]

()

결과 및 고찰

fig. variation of pKa value of amino acid.

fig. variation of total charge of PA.

fig3.은 9가지 전위를 띄는 residual들이 순수 용매 하에서 pKa값들의 변화를 보여주는 그림이다. Arg이 가장 큰 변화를 보이고 대부분이 물에 비하여 pKa값이 떨어지나 Asp, Glu는 증가하는 경향을 보인다. 이를 토대로 pH6에서 H-H equation을 이용하여 PA의 부분 전위를 주고 다시 전체 전위를 구해보면 fig4.와 같이 된다. 물에 유기용매를 1%, 10%, 20% 섞어 주었을 때 점차 음전위를 띄는 것을 알 수 있다. 또 유기용매의 유전상수가 단백질 자체의 유전상수와 비슷한 값을 가지는 경우 가장 큰 음전위를 갖는 것을 알 수 있다.

결  론

물(pH6)에서 PA의 active site가 가장 잘 보이는 부분에서의 potential field의 2차원 contour 그림을 그려보면 다음과 같다.

fig. Potential field of PA.

fig. in red rectangle of fig5

fig6.는 active site를 확대하여 그린 것이다. PA의 substrate와의 binding에 중요한 A142, A146, B57, B154, B177 residual들의 위치를 표시하였다. 마찬가지로 여러 가지 유기용매에 대하여 PA의 active site근처에서의 potential field를 살펴보자.

fig. in water.

fig. in glycerol(2%).

fig. in ethyl acetate(2%).

물(유전상수 78)에서의 반응속도를 100으로 두면 glycerol(유전상수 42.5)에서는 약 102, ethyl acetate(유전상수 6.02)에서는 31정도의 실험 결과가 있다. 위의 fig7, 8, 9에서 비교할 수 있듯이 물, glycerol에서는 active site근처에서 양전위의 channel이 생겨 음전위를 띈 반응물 POM-6-APA가 반응에 중요한 다섯 가지 residual과 결합이 잘 되도록 active site로 들어 올 수 있게 되나 ethyl acetate에서는 그렇지 못함을 관찰할 수 정성적인 결론을 지을 수 있다.

33가지 유기용매에 대한 반응속도의 실험치를 연관시켜보면 fig10.에서 보다시피 좋은 연관관계를 지을 수 없다. 그러나 계산된 전위 데이터를 통하여 PA의 active site와 POM-6-APA의 결합에너지를 계산하여 보았다. 이것은 University of Huston Brownian Dynamics(UHBD)를 이용하여 계산하였다. 이 경우 fig11.에서 보듯이 좋은 연관관계를 구할 수 있다. 이를 전체전위와 결합에너지를 도식하여 선형 보간을 하면 표준편차 91.43%의 좋은 관계를 구할 수 있다.

fig. correlation between total charge and experimental reaction rate.

fig. correlation between

total charge and binding energy.

감  사

이 논문은 1998년 한국학술진흥재단의 학술연구비에 의하여 지원되었습니다.

참고문헌

1.  Min Gon Kim and Sun Bok Lee, J. Mol. Cat. B Enzymatic, 1, 181(1996)

2.  Jeffry D. Madura, James M. Briggs, Rebecca C. Wade, Malcolm E. Davis, Brock A. Luty, Andrew Ilin, Jan Antosiewicz, Micheal K. Gilson, Babak Bagheri, L. Ridgway Scott and J. Andrew McCammon, Compt. Phys. Comm., 91, 57(1995)

3.  B. J. Yoon and A. M. Lenhoff, J. Compt. Chem., 11, 9, 1080(1990)