Lignin Peroxidase에 의한 염료의 색도 제거

이기동, 최승인, 성문수, 정욱진

명지대학교 청정기술원/ 환경·생물공학 전공

Decolorization of Dyes by Lignin Peroxidase

Ki-Dong Lee, Seung-In Choi, Mun-Su Sung, Wook-Jin Chung

Research Institute for Clean Technology/ Department of Environmental Engineering and Biotechnology, Myong-Ji University

서론

Lignin peroxidase (LiP)는 대부분의 백색부후균과 일부의 원핵생물에서 생산되어지는 효소로서 목재성분 중의 난분해성인 lignin을 분해하는 기작에서 중요한 역할을 수행한다. 백색부후균에 의해 질소제한 조건에서 2차대사 기간 중에 세포외적으로 분비되는 LiP는 6개의 heme protein isoenzyme을 가지며 분자량은 38∼46kDa이다. 효소반응시 H2O2를 필요로 하는 LiP는 lignin 분해에 관여하는 key enzyme으로 polycyclic aromatic hydrocarbon, chlorophenol, azo dye와 같은 난분해성 화합물들을 직접적으로 산화시킬 수 있는 것으로 보고되었고 제지· 펄프산업과 환경유해물질 처리에 대한 잠재적인 응용 때문에 광범위한 연구가 이루어져 왔다.1), 2). 9)

본 연구에서는 백색부후균으로부터 생산된 LiP를 이용하여 산업체 염색폐수를 처리하기 전에 model compound로서 단일기질의 염료를 선정하여 LiP에 의한 염료의 색도 제거능을 조사하고 또한, 염료의 색도 제거 효율을 증진시키고자 하였다.

실험

Chemicals : 본 연구에서 사용한 염료는 직접 염료인 congo red (direct red 28), 산성 염료인 acid yellow 9, acid blue 29, orange II (acid orange 7), 분산 염료인 disperse orange 11, disperse blue 1, 그리고 반응성 염료인 reactive black 5이다.7)

Enzyme preparations : 본 연구에서 사용한 LiP는 백색부후균 Phanerochaete chrysosporium PSBL-1으로부터 생산되었고, 배양 5 ∼ 6일째의 배양액을 0.45 □m 막으로 여과하여 균사체를 분리한 후, YM10 여과막과 한외여과기를 이용하여 농축하고, 24시간 투석하여 사용하였다.5), 8)

Enzyme assays : LiP 활성도는 veratryl alcohol (VA)이 veratryl aldehyde로 산화되는 반응을 이용하여 310 nm에서 초기흡광도의 변화값을 환산하여(□310 = 9,300 M-1cm-1) 계산하였다.8)

Decolorization assays : 염료의 색도 제거율은 각각의 염료의 최대 흡수파장에서 흡광도의 감소로 측정하였다.

Effect of pH on the decolorization of dyes : 반응혼합물은 50 □M dye, 0.2 unit LiP, 50 mM sodium tartrate, 2 mM VA, 0.4 mM H2O2으로 구성되어 있으며, sodium tartrate buffer의 pH를 2.5에서 5.0까지 변화시키며 염료의 색도 제거율을 측정하였다.4)

Effect of enzyme concentration on the decolorization of dyes : 반응혼합물은 50 □M dye, 50 mM sodium tartrate (pH 3.0), 2 mM VA, 0.4 mM H2O2으로 구성되어 있으며, LiP의 농도를 0.01에서 0.4 unit까지 변화시키며 염료의 색도 제거율을 측정하였다.

Effect of dye concentration on the decolorization of dyes : 반응혼합물은 0.14 unit LiP, 50 mM sodium tartrate (pH 3.0), 2 mM VA, 0.4 mM H2O2으로 구성되어 있으며, 염료의 농도를 2.5에서 180 □M까지 변화시키며 초기 2분간의 색도 제거율을 측정하였다.

Effect of VA on the decolorization of dyes : 반응혼합물은 0.06 unit LiP, 50 mM sodium tartrate (pH 3.0), 0.4 mM H2O2으로 구성되어 있으며, VA의 농도를 0에서 4 mM까지 변화시키며 염료의 색도 제거율을 측정하였다.

결과

Effect of pH on the decolorization of dyes : LiP는 산성 조건 (pH 2.5∼3.0)에서 최적의 활성을 나타내기 때문에 산성조건에서 초기 색도 제거율은 높았고 반응은 1분 이내에 거의 종료되었다. 그러나, LiP는 pH가 증가할수록 활성은 감소하지만 활성이 지속적으로 유지되기 때문에 종국적으로 최종 색도 제거율은 모든 pH에서 유사한 결과를 나타내었다 (Table 1). 염료별로 색도 제거율을 비교해보면 orange II와 acid blue 29의 색도 제거율이 80∼90%로 congo red와 acid yellow 9의 50∼70%보다 높았다. 4가지 염료의 혼합물에 대한 색도 제거율은 복합기질임에도 불구하고 50∼70% 정도를 보였고 이는 LiP의 광범위한 기질특이성에 기인하는 것으로 사료되었다. 특이할만한 점은 congo red와 acid yellow 9의 경우에 1일 경과 후에 색도 제거율이 감소하였는데, 이는 반응이 평형에 도달한 후 역반응 (재결합)이 진행된 것으로 판단되었다.4), 6), 7), 9)

Effect of enzyme concentration on the decolorization of dyes : 염료의 탈색에 미치는 효소의 농도의 영향을 평가하기 위하여 LiP의 농도별로 orange II의  색도 제거율을 측정한 결과, LiP의 농도가 증가할수록 색도 제거율도 증가하였다

Table 1. Decolorization of dyes by LiP at different pH.

		pH 2.5	pH 3.0	pH 3.5	pH 4.0	pH 4.5	pH 5.0
Congo red (484 to 577 nm)	After 1 min	28.40%	46.81%	42.85%	51.17%	41.17%	12.14%
	After 10 min	40.11%	63.86%	64.76%	69.41%	65.29%	66.82%
	After 1 day	35.34%	54.14%	51.54%	53.76%	49.76%	54.95%
Acid yellow 9 (385 nm)	After 1 min	56.20%	58.13%	55.07%	36.23%	22.56%	9.02%
	After 10 min	60.60%	61.65%	58.84%	56.81%	56.04%	54.86%
	After 1 day	45.76%	46.82%	45.50%	43.98%	42.69%	44.13%
Orange II (484 nm)	After 1 min	80.86%	81.61%	80.08%	73.91%	50.85%	28.68%
	After 10 min	81.47%	81.69%	80.08%	79.73%	80.17%	79.75%
	After 1 day	89.47%	90.16%	87.45%	86.34%	85.55%	79.75%
Acid blue 29 (601 nm)	After 1 min	82.42%	83.00%	81.22%	78.01%	49.50%	27.88%
	After 10 min	84.85%	84.85%	83.26%	82.87%	84.05%	82.30%
	After 1 day	84.27%	84.66%	83.87%	82.07%	83.46%	82.11%
Mixture of dyes (484 nm)	After 1 min	45.94%	51.64%	54.36%	36.80%	19.06%	13.95%
	After 10 min	56.81%	58.35%	62.11%	65.73%	66.66%	51.16%
	After 1 day	57.39%	53.97%	57.60%	57.60%	62.13%	49.45%

The reaction mixture consisted of 50 □M dye, 0.2 unit LiP, 2 mM VA, 0.4 mM H2O2 in 50 mM sodium tartrate (pH 2.5 to 5.0) in a total volume of 1 mL. The reaction was initiated by the addition of H2O2. Decolorization of congo red was measured at 577 nm (pH 2.5), at 559 nm (pH 3.0), at 523 nm (pH 3.5), at 505 nm (pH 4.0), at 490 nm (pH 4.5), and at 484 nm (pH 5.0), respectively. Decolorization of dye mixture was measured at 484 nm with all pH range. Dye mixture consisted of 12.5 □M of congo red, orange II, acid yellow 9, and acid blue 29, respectively.

Table 2. Effect of enzyme concentration on the decolorization of orange II by LiP.

	0.01 unit	0.02 unit	0.03 unit	0.05 unit	0.065 unit
After 1 min	5.93%	9.39%	11.86%	19.51%	28.88%
After 10 min	8.55%	16.08%	20.42%	32.03%	52.13%
After 2 day	18.38%	25.21%	44.40%	59.75%	78.29%
0.075 unit	0.1 unit	0.15 unit	0.2 unit	0.3 unit	0.4 unit
31.30%	46.58%	81.81%	85.26%	84.91%	83.39%
64.34%	88.11%	85.81%	85.17%	84.55%	83.39%
82.52%	94.44%	93.72%	92.67%	92.76%	92.50%

The reaction mixture consisted of 50 □M orange II, 2 mM VA, 0.4 mM H2O2 in 50 mM sodium tartrate (pH 3.0) in a total volume of 1 mL. The reaction was initiated by the addition of H2O2. Decolorization of orange II was measured at 484 nm.

(Table 2). 그러나, LiP의 농도가 일정 농도에 도달하면 더 이상 색도 제거율이 증가하지는 않았고 그 이상의 농도에서는 오히려 색도 제거율이 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 하지만 반응은 LiP의 농도가 증가할수록 빠르게 진행되어서 0.4 unit의 경우 반응은 20초 이내에 거의 종료되었다. 염료의 색도 제거를 위한 최적의 LiP 농도는 0.1 unit임을 확인하였다 (Figure 1).

Effect of VA on the decolorization of dyes : LiP에 의한 염료의 탈색과정에서 VA의 역할을 평가하기 위하여 반응 혼합물에 VA를 농도별로 첨가한 결과, VA의 농도가 증가할수록 색도 제거율은 급격히 상승하였다 (Figure 2). 따라서 VA가 LiP의 기질뿐만 아니라 염료의 탈색반응에서 촉진제로서 작용함을 확인할 수 있었고 VA를 첨가함으로서 염료의 색도 제거효율을 증진시킬 수 있었다.4)

Effect of dye concentration on the decolorization of dyes : 염료의 농도가 증가할수록 초기 색도 제거속도가 기질인 염료의 농도에 비례하여 증가하였고,  일정 농도에 도달하면 반응은 0차 반응으로 바뀌었다 (Figure 3). 염료별로 비교

Figure 1. Effect of enzyme concentration on the     Figure 2. Effect of VA on the decolorization

decolorization of orange II by LiP.                  of orange II by LiP.

Table 3. Michaelis-Menten kinetic parameters                                                   of dyes.

	Vmax (□M/min)	KM (□M)
Congo red	16.58	15.76
Orange II	48.95	45.06
Acid yellow 9	54.18	71.74
Acid blue 29	87.58	82.68

The reaction mixture consisted of 0.14 unit LiP, 2 mM VA, 0.4 mM H2O2 in 50 mM sodium tartrate (pH 3.0) in a total volume of 1 mL. The reaction was initiated by the addition of H2O2. Decolorization of dyes were measured at 599 nm (Congo red), at 484 nm (orange II), at 383 nm (acid yellow 9), and at 601 nm (acid blue 29), respectively.

Figure 3. Effect of dye concentration on the

initial decolorization rate by LiP.

해보면 congo red, orange II, acid yellow 9, acid blue 29 순으로 초기 색도 제거 속도가 높았고 Langmuir plot을 이용하여 각 염료의 Michaelis-Menten 매개변수를 결정하였다 (Table 3).3)

Decolorization of disperse dyes : 분산염료인 disperse blue 1과 disperse orange 11의 색도 제거율을 조사한 결과, 색도 제거율이 5∼20% 정도로 매우 저조했다. 분산염료의 용해성이 매우 낮기 때문에 수용성인 LiP 효소와의 반응성이 저해된 것으로 사료되었다.

참고문헌

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2. Collins, P. J., Field, J. A., Teunissen, P., and Dobson, A. D. W.: "Stabilization of lignin peroxidase in white rot fungi by tryptophan", Applied and Environmental Microbiology, 63, 2543-2548 (1997).

3. Lee, J. M.: "Biochemical Engineering", Prentice-Hall International Editions, 11-40 (1992).

4. Ollikka, P., alhonmaki, K., Leppanen, V. M., Glumoff, T., Raijola, T., and Suominen, I.: "Decolorization of azo, triphenyl methane, Heterocyclic, and polymeric dyes by lignin peroxidase isoenzymes from Phanerochaete chrysosporium", Applied and Environmental Microbiology, 59, 4010-4016 (1993).

5. Orth, A. B., Denny, M., and Tien, M.: "Overproduction of Lignin-Degrading Enzymes by an Isolate of Phanerochaete chrysosporium", Applied and Environmental Microbiology, 57, 2591-2596 (1991).

6. Paszczynski, A., Pasti, M. B., Goszczynski, S., Crawford, D. L. and Crawford, R. L.: "New approach to improve degradation of recalcitrant azo dyes by Streptomyces spp. and Phanerochaete chrysosporium", Enzyme MIcrob. Technol., 13, 378-384 (1991).

7. Swamy, J. and Ramsay, J. A.: "The evaluation of white rot fungi in the decolorization of textile dyes", Enzyme and Microbial Technology, 24, 130-137 (1999).

8. Tien, M. and Kirk, T. K.: "Lignin Peroxidase of Phanerochaete chrysosporium", Methods in Enzymology, 161, 238-249 (1988).

9. Tuisel, H., Sinclair, R., Bumpus, J. A., Ashbaugh, W., Brock, B. J. and Aust, S. D.: "Lignin Peroxidase H2 from Phanerochaete chrysosporium : Purification, Characterization and Stability to Temperature and pH", Archives of Biochemistry and Biophysics, 279, 158-166 (1990).