Microsphere를 이용한 단백질 분리 공정의 개발을 위한

Flux Modeling

최성욱, 윤정열*, 함승주, 김중현, 김우식

연세대학교 공과대학 화학공학과, *연세대학교 산업기술연구소,

Flux Modeling in the Filtration of

BSA-adsorbed Microspheres in Stirred Cell

Sung-Wook Choi, Jeong-Yeol Yoon*,

Seung-Joo Haam, Jung-Hyun Kim, Woo-Sik Kim

Dept. of Chemical Engineering, College of Engineering, Yonsei Univ.

서론

본 연구팀에서는 1992년 이후 microsphere에의 단백질 흡착에 관여하는 상호작용력에 대한 연구를 집중적으로 수행하여, 세가지 상호작용력 - 소수성 상호작용력, 정전기적 상호작용력, 수소 작용력 - 의 상호관계를 최초로 규명해 내었다[1-3]. 이 결과를 이용하면 microsphere 표면에 단백질이 선택적으로 흡착/탈착하는 것을 정확히 제어할 수가 있으며, 본 연구팀에서는 회분식 실험을 통해 성공적으로 단백질을 분리해낸 바 있다[4]. 한편, 단백질 분리의 연속 공정 개발을 위하여 단백질 농축/정제, 라텍스 정제에 사용되는 stirred cell을 크로마토그래피의 칼럼대신 사용하여 연속식 분리 공정도 개발하였다[4-5]. 회분식 흡착 분리 연구 결과 낮은 표면전하밀도의 microsphere가 높은 선택도를 나타내었으며 그 주 구동력은 소수성 상호작용력이었다. 이러한 연구 결과를 바탕으로 연속식 분리 실험을 행하였으며 혼합 단백질간의 흡착 거동시 상호영향 및 flux에의 영향을 고찰한 바 있다. 그러나 이러한 결과는 평균 flux만을 고찰한 결과이며, 시간에 따른 flux연구는 아직 체계적으로 연구되지 못하였다. 따라서 본 연구에서는 시간에 따른 flux의 변화를 고찰하고 flux modeling을 통하여 단백질 분리 공정개발의 기초 자료로 이용하고자 한다.

이론

Flux modeling을 위하여 많은 model들이 제시되어 왔다. 그 중 가장 오래된 model은 저항 연속 model (resistance-in-series)이다. 이 model식 은 다음과 같이 표시된다[6].

[eqn: J={DELTA P } over {mu (R_m +R_c +R_f ) }]	(1)

Rm은 막의 고유 저항으로 일정 압력에서 순수한 물을 투과시킴으로써 얻어낼 수 있는 상수 값이다. Rc는 농도 분극 현상에의한 cake layer의 저항이며 Kozeny-Carmen 식을 이용하여 표현할 수 있다. Rf는 입자가 막 기공에 흡착하여 생기는 저항이다. 이 식을 이용하여 MF/UF의 flux modeling을 효과적으로 수행할 수 있다.

[eqn: R_c = 180 {(1- epsilon ) m_p } over {d_p ^2 epsilon^3 A_m rho_p }]	(2)

여기서, mp는 농도 분극된 microsphere의 양, dp는 입자 크기, □은 porosity of cake layer, Am은 유효막 면적, □p는 입자의 밀도이다.

[eqn: R_f = alpha M_d ^* (1-exp(-ktU(V_m -V_t ))]	(3)

□는 비례 상수, Md*는 최대 흡착된 양, k는 상수이다. U(Vm-Vt)는 단위계단함수이며 Rf가 포화 흡착 전까지는 0임을 나타낸다. 위 식을 이용하여 식 (1)은 다음과 같이 표현된다[7].

[eqn: J={DELTA P } over {mu (R_m + 180 {(1- epsilon ) m_p } over {d_p ^2 epsilon^3 A_m rho_p } + alpha M_d ^* (1-exp(-ktU(V_m - V_t )) ) }]	(4)

실험

단백질은 Sigma Chemical Co.의 bovine serum albumin (BSA, A-7906)을 탈이온 증류수에 용해시켜서 사용하였다. Stirred cell은 Amicon사의 50 ml 급을 사용하였다. Microspheres는 무유화제 유화공중합법을 이용하여 PS/PMAA microsphere를 제조하였다. 완충용액은 pH 4.5의 acetic buffer를 사용하였으며 이온강도를 0.01로 고정하였다.

Acetic buffer와 라텍스를 0.2 □m 정밀여과막 (Orange Scientific Co.)을 장착한 stirred cell에 넣어 전체 부피는 30 mL, 비표면적은 0.19 m2/mL로 만든다. Stirred cell을 교반기 위에 놓고, 약 1 m위의 높이에서 같은 buffer를 흘려주어 투과 flux를 정상상태로 만든다.

완전히 투과 flux가 정상상태로 된 후에 단백질을 step input한다. Stirred cell을 통하여 나오는 용액을 computer에 연결된 저울과 UV detector를 이용하여 flux와 흡광도를 측정한다. 위와 같은 실험을 stirred cell rpm (300, 400, 400)과 BSA 단백질의 농도 (0.1, 0.2, 0.4, 0.8 g/L)를 변화시켜 반복한다.

그림 . 실험 장치

그림  Breakthrough curve

결과 및 토의

1. PS/PMAA의 특성분석

PS/PMAA는 styrene을 주단량체 MAA를 공단량체로 하여 회분식 공중합하였으며, 카르복시 기를 갖는다. Nc (number density of surface carboxyl groups)는 0.45 nm-2이며, 수평균 직경 (Dn) 은 500 nm이다.

2. 파과곡선 고찰

Fig. 2에서 보듯이 단백질 용액의 농도가 0.1 g/L의 경우는 100 mL에서 파과가 이루어 지며, 0.2 g/L는 50 mL, 0.4 g/L는 25 mL, 0.8 g/L는 12 mL에서 각각 파과가 이루어 진다. 0.19 m2/mL의 비표면적을 가지는 latex 30 mL는 0.01 g의 단백질을 흡착할 수 있다.

3. 투과 flux 고찰

Stirred cell을 이용하는 일반적인 막 분리 공정에서는 flux가 감소하는 것이 보통이다. 그러나 본 실험 결과에서는 flux가 증가하다가 감소함을 알 수 있다. 이것은 BSA가 microsphere에 흡착되면 서로 agglutination이 일어나 microspheres의 유효 입자 크기가 증가하기 때문이다. Batch 흡착 실험 후에 Dynamic Laser Light Scattering Method를 이용하여 agglutinated microsphere의 유효 입자 크기가 증가함을 알 수 있다. 실험 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 입자 크기가 크면 투과 flux가 크다는 것은 알려진 사실이다. 포화 흡착이 된 후에는 단백질은 더 이상 microsphere에 흡착하지 못하고 막을 통과하여 빠져 나오게 된다. 이 때 단백질은 막 기공 표면에 흡착하게 되며 따라서 투과 flux는 감소하게 된다.

즉 포화 흡착되기 전까지는 흡착이 진행되면서 연속적으로 agglutination이 일어나며 따라서 microsphere가 엉켜 큰 유효 입자 크기를 가지게 되어 투과 flux는 증가하게 된다. 하지만 포화 흡착 후에는 막 오염 (fouling)으로 인해 투과 flux가 감소하게 된다.

Stirrer speed가 커지게 되면 투과 flux는 전체적으로 증가하게 된다. 이는 shear stress가 cake layer 표면에 작용하여 layer의 두께가 얇아지기 때문이다.

4. 투과 flux modeling

식 (4)를 이용하여 flux modeling이 가능하다. 압력과 점도는 일정한 상수이다. mp는 각 stirrer speed (300, 400, 600 rpm)의 정상 상태 flux에서 retentate의 흡광도를 결정하여 계산 가능하다. Stirrer speed가 클수록 mp는 낮게 측정됨을 알 수 있으며 따라서 cake layer의 두께가 작아 투과 flux는 커진다. dp는 Fig. 3에서 보듯이 DLS (Dynamic Laser Light Scattering, ZetaPlus, Brookhaven Instruments Co., USA)를 이용하여 결정해 낼 수 있다. Vm은 Fig. 2의 breakthrough curve에서 각 단백질 농도에 대해 결정 가능한 상수 값이다. porosity of cake layer, □는 latex filtration test를 행하여 결정 가능한 상수이다. □Md*와 k의 값은 실험결과를 식 (3)으로 non-linear regression법을 이용하여 결정할 수 있다.

Flux modeling 결과를 Fig 4, 5, 6에 나타내었다. 실험 결과와 잘 일치함을 알 수 있다.

그림 4 Comparison of Comparison of modeling result with experimental data at the stirrer speed of 300 rpm

그림 3 Effective particle size verses protein concentration

그림 5 Comparison of Comparison of modeling result with experimental data at the stirrer speed of 400 rpm

그림 6 Comparison of Comparison of modeling result with experimental data at the stirrer speed of 600 rpm

참고문헌

1. J.-Y. Yoon et al., J. Colloid Interface Sci., 177, 613 (1996)

2. J.-Y. Yoon et al., Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 12, 15 (1998)

3. J.-Y. Yoon et al., Colloids Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects, in press (1999)

4. J.-Y. Yoon et al., Colloids Surfaces B: Biointerfaces, 10, 365 (1998)

5. J.H. Lee et al., Biomed. Chromatogr., 12, 330 (1998)

6. Yonghun Lee et al. J. Membr. Sci., 149, 181 (1998)

7. Suki, A.B. et al., J. Membr. Sci., 21, 269 (1984).