도꼬마리 식물세포주로부터 현탁배양을 위한 배양조건 최적화

박재성, 남민희*, 박선호

계명대학교 공과대학 화학공학과, 농촌진흥청 영남농업시험장*

Optimization of Culture Condition for Suspension Cell Culture

from Plant cell of Xanthium strumarium L.

Jae Sung Park, Min Hee Nam*, Sun Ho Park

School of Chemical Engineering and Material Engineering,

Keimyung University, Taegu 704-701

* National Teongnam Agricultural Experiment Station,

RDA, Milyang 627-130, Korea

서론

식물은 오랫동안 인류에게 매우 유용한 물질들의 공급원 역할을 해 왔으며 대부분 이차대사산물(secondary metabolites)인 이들 유용물질들은 의약품, 향신료, 방향제, 색소, 살충제 및 고순도 화학제품 등 여러 가지 용도로 사용된다. 또한 그 규모는 전세계 의약품 시장의 25%에 달하고 있으며 미국에서만 90억 달러 이상의 판매고 및 매년 1600개 이상의 식물 유래 신물질이 발견되어왔다. 그러나 생화학물질의 생산에 있어 식물을 재배하고 추출, 정제하는 것은 지리적, 기후적, 재배환경등의 변화에 제약이 많아 이를 극복하기 위해 생물반응기를 이용한 식물세포배양에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(1). 국화과(Compositae)에 속하는 도꼬마리(Xanthium strumarium L.)는 한국, 일본, 아시아, 유럽 등지에 분포하는 한해살이 풀로 열매를 말린 것은 창이자라 하며 이는 해열, 발한, 진통, 산풍, 거습, 궤양성 피부병, 신경통, 천연두 및 악성 종양에 효과가 있으며(2), 항균효과로는 티푸스군, 이질균, 황색 포도상 구균에 저해효과가 있다(3). 창이엽에는 거풍습, 진통, 해열, 살충 등 다양한 효능이 있으며(4). 뿌리는 강장제, 갑상선, 암에 효과가 있으며(5), 줄기는 저혈당증을 유발하는 것으로 보고되고 있다(6). 그러나 도꼬마리에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이라 단지 고체배지에서 생장조절제별로 callus 유기실험을 한 정도이다. 도꼬마리의 식물세포배양공정을 통한 유용물질의 대량생산을 위해서는 고생산성세포주선별기술과 돌연변이, 유전자재조합기술 등을 이용한 생물공학적 방법 및 생산성 향상에 관련된 인자들에 대한 체계적인 배양공정기술의 확립의 연구가 필요하다.

본 연구에서는 도꼬마리 식물 세포배양에 의한 고부가가치성 유용물질 대량생산을 목적으로 최적 조건에서 유기되어 세포 배양이 가능한 callus를 사용하여 각 부위별로 식물세포주를 선발하였으며 세포주 성장의 최적 조건을 잡아가고 있다.

실험재료 및 방법

1. 식물체 및 callus 유기

한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium L)의 종자를 성주에서 채취하여 외피를 제거한 후 이를 95% ethanol에 2분동안 담궈둔다. 그런 후 4% sodium hypochlorite에 Tween 20(2-3 방울/100mL) 을 넣어 만든 용액에 종자를 담궈 1시간동안 진공으로 멸균한 후 초순수 증류수로 3-4회 헹구어 낸 다음 멸균된 filter paper위에서 수분을 제거한다. 이렇게 준비된 종자를 MS(Murashige and Skoog) 고체 배지에 25℃, 암조건에서 배양하여 식물체를 얻었다.

Callus는 MS 고체 배지상에서 25℃, 암조건으로 도꼬마리 식물체의 자엽, 잎, 배축, 뿌리와 종자의 부위별로 생장조절제 NAA 2ppm+BA 2ppm +ABA 1ppm의 첨가 조건에서 유기되었다.

2. 도꼬마리 식물체의 부위별 식물세포주 선발

도꼬마리 식물체의 자엽, 잎, 배축, 뿌리, 종자부위에서 유기된 callus를 사용하였으며, MS 배지를 기본배지로 25℃, 명배양실에서 회전식 shaker 110rpm으로 flask상에서 배양하였다. 세포의 현탁배양을 위해 생장조절제 첨가별로 세포현탁배양을 실시하였다. (1) NAA 2ppm, (2) 2,4-D 2ppm, (3) NAA 2ppm+Kinetin 2ppm+ABA 1ppm, (4) NAA 2ppm+Kinetin 5ppm+ABA 1ppm, (5) 2,4-D 2ppm+Kinetin 2ppm+ABA 1ppm, (6) NAA 2ppm+BA 1ppm+ABA 1ppm, NAA 2ppm+BA 2ppm+ABA 1ppm,

3. 선발된 세포주의 안정화 및 flask 배양 최적화

선발된 세포주들의 안정화를 수행하기 위해 flask상에서 계속적인 계대배양을 수행하였으며 그 중 생리활성물질을 생산하는 것으로 보고된 뿌리 부위의 세포주를 이용하여 배지 종류별로 MS, B5, N6, AA2 배지에서 생장조절제는 NAA 2ppm+BA 2ppm+ABA 1ppm을 첨가하여 25℃, 명배양실에서 회전식 shaker로 110rpm으로 운영하며 세포 성장을 측정하여 최적 배지를 선발하였으며 또한 생장조절제 첨가별로 세포 성장실험을 수행중에 있다.

세포 농도를 측정하기 위해 fresh weight는 배양이 끝난 세포들을 여과하여 배양배지를 제거한 후 2차례 증류수로 세척하여 무게를 측정하였으며, dry cell weight는 2차례 세척된 세포들을 60℃ 건조기에서 24시간 이상 건조후 무게를 측정하였다.

결과 및 고찰

도꼬마리의 우수 callus들에서 현탁배양하여 선발한 세포주와 분열중인 과정을  Figure 1과 2에 나타내었으며 선발된 세포주는 암조건보다는 명조건에서 세포의 배양능력이 우수하며 세포의 현탁배양도 이루어졌다. 식물세포배양에 있어 선발된 세포주들은 NAA 2ppm+BA 2ppm+ABA 1ppm을 첨가한 배지에서 세포의 성장이 가장 좋았으며 2,4-D 단용, NAA 단용, NAA 2ppm+Kinetin 2ppm+ABA 1ppm이 첨가된 배지에서는 세포가 성장하지 못하였고 특히 NAA 2ppm+Kinetin 2ppm+ABA 1ppm을 첨가하여 배양한 경우에는 세포들의 aggregation이 많이 일어났다. 각 부위별로 선발된 세포주들은 안정화시키는데 약 6-7개월정도의 시간이 소요되었으며 현재 종자와 잎부위에서는 선발하여 안정화 중에 있다. 안정화된 세포주의 최대 배양 농도는 자엽의 경우 0.33g/20mL, 뿌리 0.3g/20mL, 배축 0.31g/20mL으로 나타났으며 자엽, 배축, 뿌리 부위의 경우는 배양 기간이 약 5-6일 정도이며 종자와 잎 부위에서는 20-30일 사이에 이루어지고 있으며 종자와 잎은 세포주의 농도도 나머지 3개 부위보다 낮게 나타났다.

뿌리 부위를 사용하여 배지 종류별로 세포 성장을 측정한 결과를 Table 1에 나타내었으며 기존에 세포 선발이 이루어진 MS배지보다 B5배지에서의 세포 성장이 더 좋은 것으로 나타났으며 세포의 배양 기간도 MS, N6, AA2배지에서는 6일이 경과하고 7일부터는 세포들에 갈변현상이 일어나나 B5배지에서는 8일까지 세포의 성장이 계속적으로 수행됨을 관찰할 수 있었다.

참고문헌

1. Panda, A.K., Mishra, S., Bisaria, V.S. and Bhojwani, S.: Enzyme Microb.

Technol., 11, 386-397(1989).

2. Chopra, R.N., Chopara, I.C., Handa, K.L. and Kapur, L.D.: Indigeous Drugs of

India, 2nd Edn., U. N. Dhar and sons, Calcutta, p438, (1958).

3. Lee, D.B.: Economic plants, 15, p 423(1974).

4. Talakai, T.S., Dwivedi, S.K. and Sharma, S.R.: Journal of

Ethnopharmacology, 49, 141-145(1995)

5. Mukherji, S., Banerjee, A.K. and Mitra, B.M.: Indian Journal of pharmacy,

32, 48-49(1970).

6. Dhar, M.L., Dhar, M.M., Dhawan, B.N., Mehrotra, B.N., Ray, C.: Indian

Journal of Experimental Biology, 6, 232-247(1968)

Table 1. Plant cell growth of working mediums.

Working medium	Culture period (day)	Fresh Weight (mL)	Dry Cell Weight (g/20mL)
MS	6	1.25	0.125
B5	6	2.37	0.130
N6	6	1.23	0.114
AA2	6	0.97	0.106

Figure. 1 Status of suspension cells were cultured from plant of Xanthium Strumarium L. The suspention cells were cultured at 25℃ under light condition.

Figure. 2 Division of suspension cells were cultured from plant of Xanthium Strumarium L.