미생물 담체에서 생물막 형성의 초기 거동 연구

신민수,  최호석, 박한오*

충남대학교 공과대학 화학공학과, (주) 바이오니아*

A Study on Initial Events of Biofilm Formation at Biocarriers

Min-Su Shin,  Ho-Suk Choi, Han-Oh Park*

Department of Chemical Engineering, Chungnam National University

Taejon, 305-764, Korea

Bioneer Corporation*

서론

고체 기질에 미생물의 점착 현상을 이해하는 것은 다양한 산업과 의학, 환경 분야의 기술 개발에 있어 매우 필수적이다. 특히 마이크론 사이즈의 입자와 표면사이의 상호작용은 생물학적 시스템 뿐만 아니라 많은 다른 산업 분야의 기술 개발에 중요하다. 이분야 산업적 적용의 예들로는 세척(방해하는 부유물과 먼지 입자의 제거), 종이 제조(cellulose fibres에 점토 부착), 물의 정제(sand filter에 의한 물로부터 colloid 입자 제거), 가스 정제(fiber filter에 의한 더러운 입자의 포집), 부양, fiber 제조 등이 있다. 또한 입자와 담체 표면 간의 상호 작용은 생물학적 시스템에 많이 적용되며 이러한 예들로는 cell의 접촉, cell의 점착과 부착, cell의 분리, 치아 표면에 박테리아의 점착(치석 형성의 원인), 식균작용(phagocytosis)(하나의 cell에 의해 입자의 섭취), surface-induced thrombosis 와 심장혈관의 이식에서 색전증 방해, 배 밑바닥에 미생물의 부착, 열 교환기와 냉각 탑에서 흔히 발생되는 생물학적인 오염현상과 생물학적인 부식현상의 방지를 들 수 있다. 또한 미생물과 고체 표면사이의 상호 작용은 해양 오염과 관련하여 그 중요성이 부각되고 있으며, 이것은 대량의 오염 유기물에 의한 바닷물 속 고체 표면의 생물학적 군집체(녹조류)의 형성을 통하여 그 문제점을 현실화 하고있다. 이상에서 언급된 분야에서 점착(adhesive) 현상의 광범위한 적용에도 불구하고 아직 이에 대한 정량적인 이론의 개발 및 체계적인 연구가 미흡한 실정이다. 본 실험에서는 화상분석계(image analysis system)를 사용하여 미생물의 고정화 과정을 관찰하고, 그 과정에서 형성된 생물막의 구조를 분석하여 그 형성 메카니즘을 파악하는데 있다.

실험 방법

1. 전체 시스템 구성

평판 flow cell 과 화상 분석 시스템는 Sjollema et al.(1989) 에 의해 처음 고안되었다. 그림 1은 대략적으로 보여주는 화상 분석기와 flow cell 시스템의 개략적인 설계도이다.

그림 . 1. Image analyzer와 Flow cell의 전체적인 시스템

시스템의 작동원리는 시스템이 작동하는 동안 미생물의 부유물은 폐쇄된 flow cell를 통과하며, 통과된 부유물들은 실리콘 관을 통해 정량 펌프에 의해서 다시 반응기 속으로 공급됨으로써 재순환 된다. 실험을 시작하기전 blank solution을 폐쇄된 tube나 flow cell 의 공간을 통과 시켜 기포들을 제거하며 실험이 진행되는 동안 기포의 형성을 억제하기 위해 흡입에 의해 부유물을 순환시켰다.  현미경으로부터 얻을 수 있는 화상은 flow cell 의 하단 유리판에 부착되는 미생물에 촞점을 맞추었으며 미생물들이 흡착되는 과정등을  현미경을 통해 외부 computer 모니터로부터 관찰할 수 있었다.  실제로 flow cell 의 상단과 하단을 구성하고 있는 glass 담체는 유리린스 염화나트륨 액으로 깨끗히 하였으며, 증류수로 세척하고 그런 다음 메탄올로 다시 세척한 후 최종적으로  물로 세척하였다. 투과에 의해 관찰할 수 있도록 하단판에 투명한 유리판을 장착하였다. 이를 위하여 cell의 바닦에 홈(1.8 × 1.8 ×0.03 mm )을 내어 유리에 부착되는 미생물을 관찰할 수 있도록 제작하였다. Flow cell은 두 평판사이에서 충분히 발달된 층류를 얻기 위해서, 유로의 두께와 폭을 각각 0.6mm 와 38mm로 하였으며 channel의 길이는 230mm 로 하였다.

결과 및 토론

data analysis

담체 표면에 흡착된 각각의 미생물들은 화상 분석 시스템을 이용하여 분석하였으며 이미지는 flow cell를 통과하여 glass 표면에 부착된 미생물을 캡쳐 하였다. 캡쳐된 각각의 이미지는 자동 측정을 위해 그레이 화상으로 전환 시켜 이치화를 통해 배경과 물체를 흑과 백으로 전환하였다. 미생물은 자동 측정파라미터를 이용하여 미생물의 수와 직경, 좌표, 면적 등을 분석하였으며, 여기서 흡착된 물체의 좌표 파라미터는 pixel에서의 기하학적인 중심으로 측정하였다. 직경은 원형비율의 평균값으로 측정하였으며, 미생물의 면적은 계산 factor에 의해 증가된 조직의 pixel 숫자로 측정하였다. 자동측정을 이용하여 얻은 미생물의 직경과 면적은 평균적으로 0.75□, 1.236□2의 값을 얻었다.

시간에 따른 미생물의 축적량

그림.2는 시간에 따른 미생물의 축적량을 화상분석을 통해 분석한 결과를 나타낸 것이다. 초기 시간에는 미생물의 활성화가 발달하지 못해 단위 면적당 평판 plate 에 축적되는 미생물의 수가 적었다. 하지만 시간이 경과한 후 미생물의 성장이 활발히 진행됨에 따라 단위 면적당 평판 plate에 축적량은

그림.2 시간변화에 따른 담체 표면에 미생물의 덮힘율

증가하는 것을 관찰할 수 있었으며, 진행하는 동안 흡/탈착 현상과 미생물의 motility를 관찰할 수 있었다. 초기에는 흡/탈착 현상이 자주 관찰되었으나 시간이 지남에 따라 탈착량은 흡착량에 비해 상당히 줄어들었다. 이는 초기에는 담체와 미생물간의 약한 상호작용에 의해서 가역 흡착되었다가 유체의 흐름이 나 미생물 주위에서 발생하는 eddy 현상에 의해 벌크용액속으로 떨어져 나간 것으로 볼 수 있었다. 반면 흡착량의 증가는 미생물의 증식이 점점 활성화가 되감에 따라 미생물에서 생성되는 유기물들이 담체 표면성질을 변화시켜 미생물의 축적량을 증가시킨 것으로 사료된다. 또한 흡착된 담체 표면에서의 성장과정을 관찰할 수 있고, 흡착된 미생물들의 공간좌표를 통해 미생물의 분포형태를 분석할 수 있었다.

유량 변화에 따른 미생물의 흡착량

그림.3은 일정한 미생물 농도(2.3 × 108 ∼ 2.6 × 108/ml)하에서 유량 변화와 시간에 따른 축적된 미생물 양을 나타낸 그림이다. 초기 축적된 미생물양은 흡/탈착 현상이 자주 일어나지만 완만하게 증가하는 것을 볼 수 가 있다. 이것은 초기에 미생물들이 흡착은 되지만 완전히 흡착되지 않고 담체 표면과 미생물간의 약한 상호작용에 의해 점착되어 있다가 유체의 전단응력과 다른 미생물들과의 충돌에 의해 탈착이 되기 때문이라 사료된다.

그림. 3 유량 변화에 따른 담체에 부착된 미생물 덮힘율

한편, 완전히 흡착되지 않은 미생물들은 광범위하게 분포되어 있으며 한 site 에 흡착된 미생물은 담체 표면에서 유체 흐름에 따라 유영하다가 다른 site 에 흡착된 미생물 주변에 가서 다시 흡착되기도 하며 미생물 자체운동에 의해 흐름  반대 방향으로 거슬러 올라가는 미생물도 관찰할 수 있었다.

유량이 0.37324ml/min 일 때가 가장 많이 흡착되는 것을 볼 수 있으며 유량이 증가함에 따라 흡착량은 낮은 유량일때와 비교했을 때 상당한 차이가 있음을 보여주고 있다. 이것은 벌크 용액속에 있는 유기물이 flow cell을 통과할 때 저 유속에서는 담체 표면에 잘 부착되는 반면 고 유속으로 갈수록 유속의 영향 때문에 유기물의 부착량이 감소하는 것으로 사료된다. 이러한 유기물의 부착량은 담체 표면에 부착되어 담체 표면성질을 변화시켜 미생물들이 흡착하는데 커다란 영향을 주는 것으로 사료된다. 하지만 탈착량은 흡착량에 비해 크지 않으며 이러한 탈착 원인은 여러 가지가 있지만 제일 큰 영향을 주는 변수로는 유속에 따른 전단응력이 크게 영향을 미치는 것으로 사료된다. 초기 미생물의 흡착 거동에서는 흡착 이외에 담체 표면에서 변형이나 번식하는 미생물은 관찰할 수 없었으며, 이 밖에도 담체 표면에서의 미생물의 성장과 다른 신진대사 공정들을 관찰할 수가 없었다. 흡착된 미생물은 흡착된 site 에 계속 부착되어 있는 것이 아니라 시간이 지남에 따라 미세한 속도로 이동하는 것을 관찰할 수 있었다. 대부분의 흡착은 비가역적으로 흡착되는 것으로 볼 수 있다.

참고문헌

1. Willam, G. C and Kevin, C. M., John wiley & sons, Inc. New York.,          195-240, 1990.

2. Sjollema, J.,Busscher, H. J., and Weerkamp, A. H., Journal of Microbio

-logical Methods., 9, 73-78, 1989.

3. Bos, R., van der Mei, H. C., Meinders, J. M., Busscher, H. J., Journal     of Microbiological Methods., 20, 289-305, 1994.