유전자 재조합 단백질 생산에 있어서 Hansenula polymorpha의 MOX promoter를 이용하여 알부민을 발현하는 MOX+와 mox- 균주의 methnol에 대한 특성 비교를 통한 최적 발현방법 개발

강환구, 김재호, 유은정, 유병일, 박은경, 박형수, 전희진*

한남대학교 화공고분자공학구·화학공학과

(주)한국신약 자광연구소 발효연구실*

The optimization of expression strategy for recombinant protein production with MOX+ and mox- Hansenula polymorpha

W.K. Kang, J.H. kim, E.J. Yu, B.I. You E.K. Park, H.S. Park, H.J. Chun*

Dept. of Chem. Eng., Hannam Univ.

Ja Kwang Research Institute., Han Kook Sin Yak Pharm. Co., Ltd.*

서론

Hansenula polymorpha를 이용한 재조합 단백질 발현은 Rhein Biotech에서 개발되었으며 이를 위하여 강력한 MOX(methanol oxidase)promoter와 ARS서열(HARSI, HARS2)을 이용하여 mult-copy intergrant 형태로 개발되었다. Hansenula는 Pichia와 Candida 그리고 Torulopsis와 함께 methanol을 유일한 탄소 및 에너지원으로 사용할 수 있는 4가지 종류의 methylotrophic yeast인데 이들 yeast들은 methanol을 formaldehyde, formate를 거쳐 CO2로 만드는 공통된 pathway를 가지는 것으로 알려진다. 이때 MOX+와 mox- 모두 MOX promoter를 가지고 있으며 MOX+의 경우 MOX(methanol oxidase)단백질을 만들며 전체 세포단백질의 37%정도를 차지할 정도로 많이 생성되어지는 것이 특징인데 반해 mox-의 경우MOX promoter는 가지고 있으나 MOX 단백질은 만들지 않고 단지 methanol을 inducer로서만 사용하게 된다. 외래 단백질이 발현되어지기 위해서는 repressing carbon source starvation과 methanol첨가가 필요하여 지게되는데 이때 repressing carbon source starvation만에 의한 발현양은 상대적으로 낮은 편으로 알려진다. 이렇듯 같은 methylotrophic yeast 이지만 이 H. polymorpha MOX+와 mox-는 여러 가지 차이점이 있을 수 있다고 생각되어 methanol에 대한 특성 비교를 통한 각각의 최적 발현방법에 관한 연구를 다음과 같이 수행하였다.

실험

본 연구에 사용된 H. polymorpha host는 leucine과  uracil auxotroph이며 MOX(Methanol oxidase) promoter를 가지고 있으며 MOX+LEU+(DL!L/HSA)는 유전자 부위로 MOX terminator와 albumin gene segment를 가진 vector가 삽입되어 있고, mox-leu-(DLT2/HSA)는 숙주의 MOX 유전자 대신에 알부민 발현 카세트를 대치한 것이다. 이들 균주의 기초적인 회분식 실험은 500ml의 baffled flask를 이용하여 100ml의 배지에 종배양액 1%를 접종한후 250rpm, 37℃ 진탕배양기에서 수행하였다. complex 배지는 기본적으로 yeast extract 20g/L, glycerol의 경우 MOX+는 10g/L, mox-는 20g/L를 사용하였고 메탄올은 메탄올 농도 실험을 제외하고 MOX+는 8g/L-13g/L를 mox-는 1g/L-2g/L농도를 유지하였다.  Fed-batch 실험의 경우는 5L fermenter를 사용하여 2L의 배양액를 기준으로 종배양액 5%를 접종하여 37℃, 300-800rpm, pH6.5 내지 6.9에서 feristaltic pump를 이용하여 미리 준비된 배지를 컴퓨터를 이용하여 공급하는 방법으로 실험을 진행하였다. 세포농도는 분광광도계(Milton roy. spectronic 21)를 이용하여 660nm에서 구한 흡광도를 나타내었으며 본 실험에서 target 단백질인 albumin을 정량분석하기 위하여 세포배양후 13,000rpm에서 2분간 원심분리하여 상등액을 가지고 SDS page/Silver, Coomassie staining 방법으로 알고 있는 양의  albumin standard와 비교하여 정량 하였다.

결과 및 고찰

Hansenula polymorpha MOX promoter를 이용하여 알부민을 발현하는 두가지 균주 MOX+와 mox-의 inducer인 methnol에 대한 특성을 비교하고 최적 발현방법을 확립하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

먼저 MOX promoter inducer로 작용하는 methanol의 농도가 균주의 성장 및 알부민 발현에 미치는 영향을 알아보기 위한 실험을 수행하였다. MOX+의 경우는 13 g/L에서 균주성장과 알부민의 발현양이 최대치를 보였고 3g/L, 5g/L 농도에서는 13g/L 경우 보다 균주의 성장속도가 늦고 알부민 발현에 있어서도 13g/L 경우의 약 50-60%정도인 것을 확인하였으며 이 결과를 Fig.1에 나타내었다. 반면 mox-는 MOX promoter를 가지고 있으나 methanol을 탄소원으로 사용하지 않고 다만 inducer로만 사용되어지기 때문에 각 메탄올 농도에서 균주의 성장에는 큰 차이를 보이지 않았으나 Fig.2에서 보는 바와 같이 1g/L 경우와 비교하여 0.5g/L, 5g/L에서는 발현양이 약 50%이하로 떨어지는 것을 알 수 있다.

메탄올 첨가시기가 두 균주의 성장 및 알부민 발현에 미치는 영향을 확인하는 실험을 수행하였다. 균주를 접종하면서 초기에 methanol을 첨가해 주었을 때와 균주의 exponential growth stage인 O.D. 약 5정도에서 첨가하는 경우 그리고 glycerol이 완전히 소모되고 난 후에 메탄올을 첨가해 주는 경우를 비교하여 이 실험의 결과를 Fig.3과 Fig.4에 나타내었다. 결과에서 보는 바와 같이 두 균주 모두 세포농도의 경우 첨가시기와는 무관하나 알부민 발현에 있어서 초기에 메탄올을 첨가해 주었을 때 최적 메탄올 첨가시기의 발현양30%정도가 감소하고 glycerol이 완전히 소모 후 메탄올을 첨가하는 경우 약 20%정도가 감소하는 경향을 결과를 통해 알 수 있었다.

H. polymorpha를 이용해 알부민 생성을 최적화하기 위해서는 flask level에서 scale-up하여 Fed-batch 실험시 pH와 온도 그리고 rpm의 조절에 의한 DO를 일정하게 유지하면서 feristaltic pump를 이용하여 미리 준비된 배지를 컴퓨터를 이용하여 공급하는 방법으로 specific cell growth rate를 control하면서 세포농도를 높인 후 바로 methanol로 바꾸었을 때와 어느 정도 세포농도 증가 후 specific cell growth rate를 0.1에서 0.02로 차츰 낮춘 후에 methanol로 바꾸어 주었을 때의 알부민 발현 정도를 비교하였으며 그 결과 Fig.5와 Fig.6에서 보는 바와 같이 glycerol을 이용하여 세포 비성장속도를 0.1에서 0.08, 0.06 그리고 0.02로 4시간 간격으로 서서히 메탄올에 inhibition을 받지 않게 메탄올로 change해 주었을 때glycerol을 이용 비성장속도를 0.1에서 유지하다가 갑자기 메탄올로 바꾸어 주었을 때보다 알부민 발현에 있어서 약 250%정도의 증가를 보였다. 이것은 MOX+의 경우 메탄올을 탄소원으로 사용하기는 하지만 glycerol이 어느정도 존재할 경우메탄올 전환 효소인 MOX가 induce되어지지 않음으로 인하여 glycerol로부터

메탄올로의 smooth한 substrate transition이 필요하기 때문으로 생각된다. 반면 mox-의 경우는 이와 달리 methanol을 전혀 탄소원으로 사용하지 못하기 때문에 soft-landing으로 세포의 비성장속도를 낮출 경우 glycerol을 대처할 탄소원이 부족해지면서 알부민 발현에 지장을 주는 것으로 보여지며, 그 결과를 Fig.7과 Fig.8에 나타내었다. 이 결과 specific cell growth rate를 0.1로 일정하게 유지하다가 메탄올로 바로 바꾸어 주었을 때 세포 비성장속도를 차츰 줄여주었을 때보다 약 60% 정도 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

이 결과 두 균주에 대한 특성을 위 실험 결과를 통해 비교할 수 있었으며 <표1>에 그 결과를 수치로 비교하여 나타내었다.

<표1>

Hansenula polymorpha	methanol consumption rate(g MeOH/L.hr.O.D.)			specific albumin expression rate(mg albumin/L.hr.O.D.)
	batch (flask)	fed-batch		batch (flask)	fed-batch
		abrupt	gradual		abrupt	gradual
MOX+	0.04	0.08	0.16	0.11	0.36	0.8
mox-	0.013	0.026	0.018	0.34	1.67	0.52

참고문헌

1.  Schekman, R.(1985), Protein localization and membrane traffic in yeast Ann. Rev. Cell Biol., 1, p115

2. Gellissen G., Z.A. Janowicz and C.P. Hollenberg(1992), Heterologous protein production in yeast, Biotech. Adv., 10, p179

3. Gellissen G. and C.P. Hollenberg(1995), Gene expression in methylo- trophic yeasts, Marcel dekker, Inc.

4. Cregg J.M., J.F. Tschopp, C. Stillman(1987), High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the metylotrophic yeast, Pichia pastiros, Bio/Technology, 5, p497

5. Cregg, J.M., and C.R. William(1993), Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris, Biotechnology, 11, p905