입체선택성 단백질을 이용한 광학이성체 분리기술

김권일, 이기세

명지대학교 환경·생물공학전공, 청정기술원

Chiral Separation Using Stereoselective Proteins

Kwonil Kim and Kisay Lee

Dept. of Environmental Engineering and Biotechnology

Research Institute for Clean Technology

서 론

L-MSG(monosodium glutamate)는 좋은 맛을 내지만 D-MSG는 무미하거나 쓴맛을 느끼게 한다.  Warfarin의 경우 S-form은 R-form에 비해 5배나 강한 혈액항응고 활성이 있다.  D-methorphan은 효능 있는 antitussive로 사용되나 L-methorphan은 항정신성 의약품으로 분류된다.  이와 같이 같은 명칭의 물질이더라도 서로 다른 광학이성체 활성의 차이로 인하여 의약, 농업, 정밀화학 등의 분야에서 광학이성체의 용도, 경제성, 생체 안전성 등의 측면에서 그 순도가 매우 중요한 인자가 된다.

<표1> 대표적인 광학이성체의 활성 차이

물질명	광학이성체의 활성
amphetamine	d-form만이 CNS stimulant
ascorbic acid	(+)-form만이 antiascorbutic activity
propoxyphene	□-d form은 antitussive, □-l form은 analgesic
epinephrine	(-)-form이 (+)-form보다 10배 강한 vasoconstrictor
synephrine	(-)-form이 (+)-form보다 60배 강한 pressor activity
quinidine	(+)-form만이 cardiac suppressant effect
bermethrin	d-form 이 더 강한 insecticide
propranolol	S-form만이 □-adrenergic blocking activity
warfarin	S-form이 R-form보다 5배 강한 혈액항응고제

광학이성체 분리기술

현재까지 광학이성체의 분리는 대부분 결정화 반응에 의해 수행하는 것이 일반적이지만 의약품으로 사용하기에는 순도가 만족할 만큼 높지 못하기 때문에 불필요한 이성체가 소량 섞여도 큰 부작용이 없는 경우에만 제한적으로 사용되고 있다.  관련 연구자들로부터 가장 효율적으로 광학이성체를 분리하는 방법으로 인식되고 있는 방법은 크로마토그래피 기술이며 광학이성체 분리에 응용된 역사도 꽤 오래되었다.

광학이성체 분리를 위한 크로마토그래피에 대한 중요한 기록들로는 1939년 lactose 칼럼을 이용하여 camphor 유도체를 분리한 것을 시초로, 1952년 종이크로마토그래피를 이용한 아미노산 분리, 1971년 chiral 리간드 크로마토그래피의 이용, 1979년 silica를 이용한 chiral 분리용 고정상 개발, 1984년 cyclodextrin의 이용 등을 들 수 있다.  하지만 크로마토그래피 기술은 그동안 결정화기술에 비해 비용이 많이 들어 비경제적이며, 한가지 고정상이 분리하려는 광학이성체 특성에 따라 일반적 적용성이 부족하고, scale-up이 어렵다는 단점들 때문에 산업적으로 크게 주목을 받지 못하고 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)이나 HPLC에 의한 분석용 기술에만 제한적으로 사용되고 있다.

현재까지 광학이성체 분리에 사용되는 크로마토그래피 고정상은 그 기작에 따라 다음과 같이 5가지로 분류할 수 있다.  (i) brush-type selector: 용질과 고정상 사이의 □-□ 상호작용, 수소결합, 쌍극자 인력 등의 차이를 이용하여 분리하는 방법으로 일반적으로 아미노산 유도체를 고정화시켜 고정상으로 사용한다. (ii) helix-type selector: cellulose, amylose 등 polysaccharide의 carbamate를 고정상으로 이용하여 광학이성체의 고분자 입체구조 선택성 차이로 분리한다. (iii) ligand exchange: 아미노산-전이금속 complex가 결합된 고정상에 광학이성체가 복합 chelate를 이루는 성질 차이를 이용한다. (iv) cavity-type selector: crown ether나 cyclodextrin을 고정화시켜 분자내 공간에 용질을 inclusion시킨다. (v) protein selector: 단백질의 입체구조가 광학이성체 인식 및 결합하는 차이를 이용한다.

광학이성체 분리용 단백질 selector

이중 단백질을 chiral selector로 이용하는 방법은 가장 최근에 많은 관심이 집중되고 있는 분야인데, 그 이유는 단백질 자체가 기본적으로 chiral이며 위의 여타 방법에 비해 광학이성체에 대한 선택성과 적용범위가 크기 때문이다.  최근 모세관 전기영동이나 소형 분석용 HPLC를 위하여 몇가지 상용화된 칼럼이 판매되기 시작하였으며 여기에 사용되는 고정화된 단백질은 <표2>와 같다.

BSA와 AGP는 혈장단백질로써 생체내에서 다양한 종류의 유기성·무기성 화합물을 전달하는데 관여하는 단백질들이므로 광학이성체의 차이를 인식할 수 있는 기능이 있는 것으로 여겨진다.  CBH1은 fungal cellulase이며 OVM은 carbohydrate를 포함하는 glycoprotein으로써 양이온성 chiral 화합물을 인식하는 기능이 있는데, 이 둘의 탄수화물의 입체구조를 인식하는 능력이 chiral separation 기능을 주는 것으로 여겨지고 있다.

모세관 전기영동에서는 이와 같이 다양한 광학이성체 화합물에 대한 높은 선택성의 잇점을 살려 스웨덴, 독일, 일본, 미국 등에서는 단백질 selector를 고정상으로 채용한 칼럼들이 이미 다수 상용화되어 있으며, 최근 문헌에서는 분석용 HPLC 칼럼 개발 및 제조용으로의 scale-up 연구가 활발히 진행되고 있다.

<표2> 모세관 전기영동 및 분석용 HPLC에 사용되는 protein selector

Protein	Source	Examples of chiral separation
BSA (bovine serum albumin)	bovine plasma	benzoin, warfarin, ibuprofen, mandelic acid, epinastine, propanolol, pantoprazole, leucovorin, folinic acid, omeprazole, etodolac, mefloquin 등
AGP (□1-acid glycoprotein)	human plasma	alprenolol, benzoin, cyclophosphamide, disopyramide, hexobarbitol, phenylephrine, nicardipine, metoprolol, ketamine, sulpiride, trimebutine, primaquine, mexiletine 등
OVM (ovomucoid)	hen egg white	arotinolol, benzoin, pindolol, primaquine, verapamil, tolperisone, trimebutine 등
CBH-1 (cellobio- hydrolase)	T. reesei	alprenolol, metoprolol, propanolol, labetolol pindolol, acetobutolol, prenaltrol 등

단백질 용액을 이용한 chiral separation

분석용 모세관 전기영동에 의해 광학이성체를 분리하기 위해 처음에 사용된 방법은 mobile phase용 buffer에 분리하고자 하는 racemic mixture와 selector protein을 함께 loading하는 것이었다.  이 경우 selector protein을 running buffer additive로 사용한다고 표현한다.  예를 들어 어떤 racemate의 R-form이 S-form 보다 선택적으로 사용한 단백질에 대해 친화력이 있으면 R-form과 단백질이 결합한 복합체가 자유로운 S-form 보다 모세관을 이동하는 속도가 느리게되므로 두가지의 resolution이 가능하게 된다. 복합체와 자유 racemate의 이동속도 차이를 증폭시키기 위해 제3의 additive를 사용하기도 한다.

단백질 고정상을 이용한 chiral separation

단백질 selector를 고정화시킨 칼럼을 이용하여 광학이성체를 분리하는 기술은 모세관 전기영동에서도 사용되어 왔으며 최근 분석용 HPLC에서도 사용이 시도되고 있다.  그리고 일부 선진국에서는 제조용 HPLC 내지는 MPLC 규모로의 응용에 많은 관심을 기울이고 있다.  이를 위해서는 기본적으로 ligand라고 할 수 있는 selector protein을 inert support에 고정화 내지는 흡착을 시켜야 하며, 이때 분리하고자 하는 racemate에 대해 단백질의 입체선택성 active site가 고정화반응에 의해 차단되거나 활성을 잃지 않게 하는 것이 중요하다. 이것을 방지하기 위해 목적으로 하는 racemate가 이미 결합된 단백질을 고정화하는 방법을 사용할 수 있다.

연구 방향

단백질 selector를 이용한 chiral separation에 있어서 앞으로 연구가 필요한 분야로는 첫째, 기존에 chiral selector로 알려진 단백질 이외에 이들보다 입체선택성이 우수하거나 보다 경제적으로 공급할 수 있는 단백질을 검색하는 것이고 아울러 기존의 분리 가능하다고 알려진 racemate 이외resolution이 가능한 적용범위를 확대하고 separation factor 등의 자료를 확립하는 것을 들 수 있다.  Chiral selector로 사용 가능한 단백질은 주로 생체 내에서 화합물의 전달에 관여하거나 carbohydrate 구조특이성을 인식할 수 있는 단백질이므로 HSA, conalbumin, transferrin, casein, avidin, pepsin 등이나 막수송 및 전자전달계에 관여하는 단백질들을 대상으로 할 수 있을 것이다.

또한 Sepharose, dextran, ion exchanger, silica 등 support 중에서 분리하고자 하는 racemate와 단백질 특성에 적합한 것을 비교 선택하며 단백질 특성별로도 support 표면을 활성화하는 각종 방법을 비교 검토하여 장기간 사용에도 단백질 결합 손실이 적은 효율적인 고정화방법을 연구하는 것이 필요하다.

실제 HPLC 이상의 규모에서 chiral retention 차이 확대를 위한 크로마토그래피 운전 전략 연구가 수반되어야 한다. 고정화된 단백질은 amphoteric이므로 pH에 따라 전하특성이 변할 수 있으며 이것이 racemate 종류별 분리타당성을 결정할 수 있다.  예를 들어 AGP는 등전점 pI가 2.7 근처이므로 pH 6-9 에서는 양이온성 용질의 retention이 증가하는 경향이 있는 것으로 알려져 있다.  따라서 mobile phase나 elution buffer의 pH 및 ionic strength같은 변수들이 racemate의 칼럼내 retention에 영향을 줄 수 있고 이들의 영향을 조절함으로써 그 차이를 증폭시킬 수 있을 것이다. 또한 mobile phase 내에 유기산, 유기용매, sugar 등의 organic modifier를 적절히 사용함으로써 chiral 화합물의 고정상 내에서의 retention과 입체특이성을 보다 크게 차이 나게 하는 것도 가능하다.

참고문헌

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Hage, D.: "Chiral separations in capillary electrophoresis using proteins as stereoselective binding agents," Electrophoresis, 18, 2311 (1997).

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