이상수용액시스템에서 Torulopsis bombicola ATCC 22214에 의해 생산된 Sophorolipid 분배특성에 관한 연구

조 용 남, 김 윤 관, 최승인, 정 욱 진

명지대학교 청정기술원/환경·생물공학 전공

Partitioning of Sophorolipid by Torulopsis bombicola ATCC 22214 in Polyethylene Glycol/Phosphate Aqueous Two-Phase Systems

Yong-nam Cho, Yun-kwan Kim, Seoung-In Choi,Wook-jin Chung

Research Institute for Clean Technology/Department of Environmental Engineering and Biotechnology, Myong-Ji University

서론

토양입자에 흡착되어 있는 유류오염물질에 대해 탁월한 세척효과를 나타내는 생분해성 생물계면활성제 중 sophorolipid는 Torulopsis bombicola균주가 세포외로 생산이 되며 생산성을 증진시키기위해서 발효액내의 sophorolipid를 발효와 동시에 제거시킬수 있는 공정을 이용하면 생산성을 획기적으로 증진시킬수 있다.  이상수용액시스템(aqueous two-phase fermentation)에서의 발효는 단백질과 같은 biomolecules을 미생물로부터 분리 및 생산하는 연속공정에 주로 응용이 되어 왔다. 본 실험에서는 생물계면활성제 생산제품을 적절한 이상분리 시스템을 개발하여 in-situ ferementation 중 분리고자 한다. 보통 이상분리에 자주 사용되는  polyethylene glycol (PEG)/dextran (Dex) 시스템과 같은 폴리머-폴리머 상 시스템은 Dextran의 높은 가격과 높은 점도와 같은 문제점이 있어서 본 실험에서는 가격이 저렴한 salt를 dextran대신 사용할수 있는 가능성을 실험하였다. 기초 실험으로써 발효액내의 sophorolipid등의 생물계면활성제의 PEG/salt시스템에서의 최대분리를 위한 적정 염 농도, 고분자 농도, 분자량, pH 및 적정 반응조건에 따른 분배계수에 대한 영향을 조사하고 동시에 합성계면활성제에 대한 조사도 실시하였다. 또한, 추후 실험에서 염농도가 세포생장에 미치는 영향도 조사하여 실제 발효중의 이상수용액 시스템 적용 가능성도 조사하고자 한다.

실험

균주 배양조건

본 실험에서는 ATCC에서 구입한 시험균주 Torulopsis. bombicola(ATCC 22214)를 이용하여 sophorolipid를 생산하였으며 YMPG 배지(yeast extract 3g, malt extract3g, peptone 5g, glucose 10g in 1L)에 접종하여 24시간 동안 배양하여 얻은 preculture 2ml를 250ml 삼각플라스크내의 100ml 배지에 재접종한 후 30℃, 250rpm에서 60시간 동안 배양한다. 배지의 조성은 1L를 기준으로 KH2PO4 1g, MgSO4 5g, NaCl 0.1g, glucose 100g, yeast extract 2g, urea 0.5g, vegetable oil 100g, FeCl3 0.1g이다. Biosufactant의 추출은 ethylacetate를 추출용매제로 사용하였다.

고분자 물질 및  염을 이용한 two-phase 분리

발효생산품중 product는 대개의 경우 product inhibition을 나타내어 in-situ fermentation중 생산제품인 sophorolipids를 제거할 수 있는 기술인 흡착제 이용 및 Two phase fermentation 기술을 이용하면 생산성 향상을 기대할 수 있다. Flask 실험을 통하여 상층 이상분리용 고분자로 PEG(polyethylene glycol) 20%(w/w)와 하층 이상분리용 고분자로 KPi(KH2PO4 : K2HPO4, 4 : 1) 8%를 이용하여 cell partition과 surfactant 종류(SDS, Tween 80, Phenyl-glucocide, Bacitracyn, soporolipid)에 따른 분배계수를 측정하여 적정 분리 조건을 발견하였다.

결과 및 고찰

발효생산품중 product는 대개의 경우 product inhibition을 나타내므로 in-situ fermentation중 생산제품인 sophorolipids를 제거할 수 있는 Two phase fermentation 기술을 이용하면 생산성 향상을 기대할 수 있다.  sophorolipids의 약 80% 가량이 extracellular로 생산되므로 이상분리용 고분자 만을 이용하여 연속배양에 의한 sophorolipids의 생산이 가능할 것으로 판단된다.

따라서, 이상분리용 고분자와 salt를 이용한 상분리와 분배계수를  측정하여  분배조건의 적정 조건을 발견하고자 실험을 수행하였다. 이상분리를 위하여 본 연구에서는 상층 이상분리용 고분자로 polyethylene glycol(PEG)  20%(w/w)를 사용하였고, 하층 이상분리용 물질로 KPi(KH2PO4 : K2HPO4, 1 : 4)을 사용하였다. 효과적인 상층 이상분리용 고분자로서 PEG 6000을 선택하였고 또한, 하층의 경우 KPi가 Dextran보다 가격대 성능비(동량을 기준으로, 가격은 약 200배이상 dextran이 고가이나, 분리능은 약 1.3배 정도)가 우수하다고 보고되었다. 현탁세포는 세포농도를 변화시켜 분배계수를 측정한 결과(Table 1) 모든 세포가 KPi-rich(하층)으로 모두 분배되는 결과를 보였다.

Table 1. Partition of T. bombicola cells in PEG/KPi system

Optical density of suspension cells	Optical density of relative cell concentration	Optical density
		top phase	bottom phase
0.187 0.098 0.052 0.028	6.68 3.5 1.85 1	- - - -	0.489 0.249 0.135 0.068

합성 계면활성제로서 음이온계 Sodium Dodecyl Sulphate(SDS)와 비이온계Polyoxyethylenesorbitan monooleate(Tween 80)를 선택하여 PEG/KPi, 각 상에 대한 분배계수를 측정하였다.(Table 2)  Sigma사에서 구입한 생물계면활성제인 Bacitracyn과 T. bombicola ATCC22214에서 생산된 sophorolipid를 사용하였다. 비이온계 synthetic surfactant로서 Tween 80는 저농도 0.025%에서 1/K값이 0.92로서 양쪽상에 대해 특별한 친화성이 보이지 않았으나 농도가 증가 할수록 하층(salt phase)로 partition되었다. 음이온계인 SDS는 분배계수를 측정한 결과, K값 95.72로 측정되어 SDS가 PEG-rich phase으로 다른 계면활성제보다 높은 분배계수를 가졌다. Polyethyleneglycol은 고립전자쌍을 지니고 있는 에테르옥시겐 결합이 반복되는 분자구조를 가진 강한 수소결합 수용체이다. 따라서  음이온계인 SDS와 비이온계인 Tween80의 큰 분배계수의 차이는 SDS가 수용액상에서 가지는 음이온이 PEG와 결합하기 때문으로 고려된다.

Table 2. Partition coefficients of synthetic surfactants in PEG/KPi aqueous two phase system

Concentration of surfactant		Optical density		Partition coefficient K	Inverse partition coefficient 1/K
surfactant	conc.(%)	top phase	bottom phase
SDS	0.1 0.2 0.4	1.459 1.034 2.393	0.035 0.048 0.025	41.686 21.542 95.720	0.023 0.046 0.010
Tween 80	0.025 0.05 0.1	0.400 0.048 0.024	0.371 0.220 0.154	1.078 0.218 0.156	0.92 4.58 6.41

Table 3. Partition coefficients of biosurfactants in PEG/KPi aqueouse two phase system.

Concentration of surfactant		Optical density		Partition coefficient K
biosurfactant	conc.(%)	top phase	bottom phase
Bacitracyn	0.05 0.1 0.15	0.200 0.499 0.776	0.021 0.102 0.153	9.524 4.892 5.072
Phenyl-glucocide	0.001 0.003 0.075	0.181 0.355 2.926	0.093 0.015 1.89	1.946 2.351 1.542
Sophorolipid	0.05 0.1 0.15	0.018 0.035 0.062	0.001 0.010 0.014	18 3.5 4.43

본 연구에서 비교 실험된 biosurfactant 중에서 phenylglucoside는 양쪽 상에 대해 특별한 친화성 나타나지 않았고 Bacitracyn과  sophorolipid가 높은 분배계수를 가짐으로 나타났다. 본 실험에서 가장 높은 분배계수 값을 보인 sophorolipid로서 저농도 0.05%일 때 K값이 18(Table 3)이었다. 따라서 PEG/KPi로 이루어진 two-phase system에서 sophorolipid가 저농도에서도 효과적으로 추출될 수 있을 가능성을 보여주었다.

향후 실험에서는 분배계수에 영향을 주는 다음 변수에 대한 영향을 조사하고자 한다.; (1) 폴리머의 타입, (2) 폴리머의 분자량과 분포, (3) tie-line의 길이, (4)염의 농도와 타입, (5) pH, (6) 온도. 이상과 같은 효과에 대한 분배계수를 측정하고 in-situ fermentation에대한 실험도 수행하고자 한다.

참고문헌

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