효소반응조건(pH, 온도, H2O2)변화에 따른 lignin peroxidase의 활성도 변화

이기동, 최승인, 성문수, 정욱진

명지대학교 청정기술원/ 환경·생물공학 전공

Effect of reaction conditions such as pH, temperature, and H2O2 on the enzymatic activity of lignin peroxidase

Ki-Dong Lee, Seung-In Choi, Mun-Su Sung, Wook-Jin Chung

Research Institute for Clean Technology/ Department of Environmental Engineering and Biotechnology, Myong-Ji University

서론

백색부후균은 목재성분 중의 리그닌물질을 분해할 수 있는 lignin peroxidase (LiP)효소를 생산하는 대표적 균주로 알려져 있으며, 일반적으로 질소가 제한된 배지조건에서 세포외적으로 분비되는 대표적인 효소들인 LiP, manganese peroxidase (MnP)등의 효소를 생산할 수 있는 균주로 보고되었다. 최근 일부 연구그룹에 의한 lysine auxotroph 백색부후균은 nutrient-rich condition하에서도 LiP 생산성이 우수한 mutant 균주를 개발한 결과도 발표하였다. 백색부후균에 의해 질소제한 조건에서 2차대사 기간 중에 세포외적으로 분비되는 LiP는 6개의 heme protein isoenzyme을 가지며 분자량은 38∼46kDa이다. 효소반응시 H2O2를 필요로 하는 LiP는 lignin 분해에 관여하는 key enzyme이다. LiP는 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠등의 방향족 난분해성 화합물 및 목재성분 중의 리그닌 물질을 분해할 수 있는 우수한 성능의 효소로 환경분야에서 이에 대한 수요가 증대될 것으로 기대되고 있으나, 국내외에서 상업적으로 전혀 생산이 안되며 또한, 미생물을 이용한 효소생산 및 효소를 이용한 난분해성 물질 처리시 효소반응성 및 활성도를 증진시키기위한 연구 또한 미비한 실정이다.1), 2)

본 연구에서는 lysine auxotroph 백색부후균(P. chrysosporium) mutant를 이용하여 세포외 효소인 LiP를 생산한 후 추출하여 염색폐수를 처리하고자 하였다.  그러나 염색폐수 분해도를 증진시키기 위해서는 효소의 활성도를 증진시켜야 하므로 효소의 반응특성에 대한 기초자료 및 효소활성도 저해인자에 대한 기초연구를 실시하여 효소 안정성을 증진시킬 수 있는 방법을 조사하고자 실험하였다.  즉, LiP가 나타내는 기질, 온도, pH에 대한 효소반응 특성을 조사한 후 pH, 온도, H2O2에 의한 효소활성도 변화를 측정하였다. 또한, 효소 활성도를 증진시킬 수 있는 물질(veratryl alcohol 및 aromatic amino acid, indolic compound)을 조사하고자 실험하였다.

실험

본 실험에서 사용한 crude LiP는 백색부후균 Phanerochaete chrysosporium PSBL-1으로부터 생산되었고, 배양 5∼6일째의 배양액을 0.45□m 막으로 여과한후, YM10 여과막과 한외여과기를 이용하여 농축하고, 24시간 투석하여 사용하였다. LiP 활성도는 veratryl alcohol(VA)이 veratryl aldehyde로 산화되는 반응을 이용하여 310nm에서 초기흡광도의 변화값을 환산하여(□310 = 9,300 M-1cm-1) 계산하였다. 반응혼합물은 enzyme solution, 50mM sodium tartrate buffer(pH 2.5), 2mM VA, 0.4mM H2O2으로 구성되어 있으며, 전체부피가 1mL가 되도록 하였다. 반응은 H2O2가 첨가되면서부터 시작된다. LiP 1 unit는 단위분당 1□mol의 VA를 veratryl aldehyde로 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.2)

LiP의 kinetic parameter를 결정하기 위하여 VA의 농도를 5□M에서 4000□M, H2O2의 농도를 5□M에서 1600□M로 각각 변화시켜서 VA가 산화되는 초기반응속도를 구하고, Michaelis-Menten 효소반응 속도식의 매개변수를 결정하였다. LiP 활성도에 대한 초기 pH, 온도의 영향을 조사하기 위하여 sodium tartrate buffer의 pH를 2.5에서 5.0으로, 온도를 4℃에서 70℃로 변화시켜서 LiP 활성도를 측정하였다. H2O2에 의한 LiP의 불활성을 조사하기 위하여 H2O2의 농도를 0에서 0.4mM로, VA의 보호효과를 조사하기 위하여 0.4mM H2O2를 포함한 LiP용액에 VA의 농도를 0에서 2mM로 변화시켜서 혼합한 후 각각 15분마다 일정부피를 취하여 LiP 활성도를 측정하였다.3), 4), 5)

결과 및 토론

LiP 효소반응의 kinetic parameter를 결정하기 위하여 VA와 H2O2의 농도를 각각 변화시켜서 초기반응속도를 구하였다. 기질인 VA의 농도가 낮은 범위에서는 반응속도가 VA의 농도에 비례하는 1차반응이었고, VA의 농도가 증가함에 따라 반응은 1차에서 0차로 바뀌었으며(Figure 1), H2O2도 같은 경향을 나타내었다(Figure 3). Michaelis-Menten 효소반응속도식의 매개변수 Vmax, KM값을 결정하기 위하여 Langmuir, Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee plot을 각각 하였고 그 중 Langmuir plot을 한 경우에서 비교적 정확한 결과를 얻을 수 있었다.5)

Figure 1. The effect of VA concentration         Figure 2. The Langmuir plot for the initial

on the initial VA oxidation rate by             VA oxidation rate by partially purified

partially purified crude LiP.                   crude LiP at various VA concentrations.

Figure 3. The effect of H2O2 concentration        Figure 4. The Langmuir plot for the initial

on the initial VA oxidation rate by            VA oxidation rate by partially purified

partially purified crude LiP.                 crude LiP at various H2O2 concentrations.

기울기와 절편값으로부터 Vmax와 KM값을 계산한 결과, VA의 Vmax = 63.25□M/min, KM = 142.77□M이며(Figure 2), H2O2의 Vmax = 82.30□M/min, KM = 270.09□M이었다(Figure 4).

LiP 활성도에 대한 초기 pH의 영향을 조사하기 위하여 buffer의 pH를 변화시켜서 실험을 수행하였다. LiP 활성도는 pH 3.0에서 가장 높았고 pH가 증가할수록 LiP 활성도가 급격하게 감소하였다(Figure 5).

LiP는 산성조건(pH 2.5∼3.0)에서 가장 높은 활성을 나타내지만 반면에 효소는 급격히 불안정해진다. 그래서 각 pH별로 시간에 따른 LiP 활성도의 변화를 확인해 보았다. 그 결과 pH 2.5와 3.0에서의 초기 LiP 활성도값은 매우 높은 반면에 시간이 경과함에 따라 LiP 활성도가 급격하게 감소되었다. pH가 증가할수록 초기 LiP 활성도는 낮아지는 반면에 안정성은 증대하여 pH 4.5 이상에서는 초기 활성도를 지속적으로 유지하였다(Figure 6).3)

Figure 5. The effect of initial pH on the        Figure 6. The time course changes of LiP

LiP activity.	activity by the initial pH change.

LiP 활성도에 대한 온도의 영향을 평가하기 위하여 반응온도를 변화시켜서 실험을 수행하였다. 4℃에서도 LiP의 활성이 나타났으며, 온도가 증가함에 따라 반응속도가 증가하므로 LiP 활성도도 증가하였다. 35℃부근에서 가장 높은 활성을 나타내었으며, 이 후에 온도가 증가함에 따라 LiP 활성도는 서서히 감소하였다. 70℃ 부근에서 LiP 활성도가 급격하게 떨어지며 완전히 활성을 잃었고 이는 고온에 의한 단백질의 변성으로 인해 LiP 활성도가 급격히 감소된 것으로 판단되었다(Figure 7).3)

Figure 7. The effect of temperature on the      Figure 8. The Arrhenius plot for the VA

LiP activity.                                    oxidation rate by LiP at various

temperatures.

Figure 8은 온도를 변화시켜서 나타낸 VA 산화반응속도에 대한 Arrhenius plot이며, 이 식은 4∼35℃ 사이의 범위에서만 적용될 수 있다. 기울기값으로부터 활성에너지를 구하였으며, E = 11.68 kJ/mol(2.78 kcal/mol)이었다.

Figure 9. Inactivation of partially purified       Figure 10. Protective effect of VA against

crude LiP by hydrogen peroxide.                 inactivation of partially purified

crude LiP by 0.4mM H2O2.

LiP는 활성을 위해 H2O2를 필요로 하지만 기질이 부족한 상태에서 H2O2가 과잉으로 존재하면 H2O2에 의해서 불활성된다. H2O2의 농도가 증가할수록 불활성되는 속도도 증가해서 0.4mM일 경우 30분만에 활성이 나타나지 않았다(Figure 9). 그러나 VA를 첨가할 경우 H2O2에 의한 LiP의 불활성이 방지되어서 1시간이 지난후에도 초기활성의 80% 이상을 유지하였다(Figure 10). 이는 VA가 H2O2에 의한 LiP의 불활성에 대한 보호작용을 함을 나타낸 것이며, VA가 LiP의 기질로써 뿐만 아니라 LiP의 촉매순환을 완성시키는 catalytic recycling agent으로써도 작용함을 암시하였다. 또한, 본 실험에서는 LiP 효소 활성도를 증진시키기 위해서 VA 및 aromatic amino acid, indolic compound의 촉진효과에 대한 실험도 수행하였다.4)

참고문헌

1. Orth, A. B., Denny, M., and Tien, M.: "Overproduction of Lignin-Degrading    Enzymes by an Isolate of Phanerochaete chrysosporium", Applied and         Environmental Microbiology, 57, 2591-2596 (1991).

2. Tien, M. and Kirk, T. K.: "Lignin Peroxidase of Phanerochaete               chrysosporium", Methods in Enzymology, 161, 238-249 (1988).

3. Tuisel, H., Sinclair, R., Bumpus, J. A., Ashbaugh, W., Brock, B. J. and       Aust, S. D.: "Lignin Peroxidase H2 from Phanerochaete chrysosporium :      Purification, Characterization and Stability to Temperature and pH",           Archives of Biochemistry and Biophysics, 279, 158-166 (1990).

4. Collins, P. J., Field, J. A., Teunissen, P., and Dobson, A. D. W.:              "Stabilization of lignin peroxidase in white rot fungi by tryptophan", Applied    and Environmental Microbiology, 63, 2543-2548 (1997).

5. Lee, J. M.: "Biochemical Engineering", Prentice-Hall International Editions,    11-40 (1992).