펩타이드 자기조직화 막을 이용한 포르피린 검출에 관한 연구

송 성훈*,**, 권 정훈*, 中村 史**, 犬山康弘***, 장 상목*, 三宅 淳**

*동아대학교 공과대학 화학공학과

**日本 工業技術院 産業技術融合領域硏究所

***日本 東和科學株式會社

Study for detection of porphyrin on self-assembled peptide membrane using Quartz Crystal Analyzer

Seong-Hun Song*,**, Jung-Hun Kwon*,  Chikashi Nakamura**, Yasuhiro Inuyama***,

Sang-Mok Chang*, Jun Miyake**

*Dept. of Chem. Eng., Dong-A Univ.

**National institute for Advanced Intersiciplinary Research, tsukuba, Japan

***Towa Kagaku Co., Ltd., Hiroshima, Japan

서론

최근 극히 초미량원소의 활동이 중대한 열쇠를 가지는 생명과학 및 환경과학의 영역에서는 보다 높은 감도와 선택성을 가진 분석법의 개발이 이전보다 절실히 요구되고 있는 실정이다. 고가의 계측기기를 이용하지 않고서도, 싸고 간편한 초고감도  스팩트럼분석법이 개발된다면, 각분야의 시급한 문제들에서 쉽게 대응하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 이러한 분석법에 있어서 포르피린화합물은 최근 뛰어난 초고감도기능을 가진 키레이트시약의 하나로서 등장하였다. 이것은 포르피린이 주기율표 속의 많은 원소(50종류 이상)과 착체를 형성할 수 있고, 더욱이 포르피린과 이 금속착체가 몰흡광계수 (□)의 큰 Soret 밴드 (발견자 J. L. Soret1)의 이름을 따서 명명되었다), 및 적색의 형광을 가진 것 등에 유래되고 있다.2)

본 연구에서는 포르피린에 대한 구조적 선택성을 가진 펩타이드, PSP2와 PSP2-B5 (Porphyrin sandwiched peptide)의 자기조직화막을 형성한 수정진동자(AT-cut 9 MHz, Seiko EG&G)를 이용하여 포르피린 농도변화에 대한 실시간 검출 모니터링을 행하였다. 또한 수정진동자의 검출한계농도이하영역에서의  포르피린농도에 대해서 Latex-beads를 이용하여 시그널을 증폭할 수 있었다.

실험

수정진동자의 한쪽 면만을 사용하기 위해서 전극이 없는 수정판을 수정진동자의 한쪽 면에 실리콘 라버를 이용하여 접착한다. 전극면의 불순물 제거를 위하여 Phiranha 용액(3:1 conc. 황산:30% 과산화수소)을 이용하여 5분간 전극면을 담궈둔 후 Milli Q, 아세톤, 에탄올 등을 이용하여 전극을 씻고, 질소가스로 건조시킨다.3)

1ml 용기에 PBS buffer (pH 7.4)에 수정진동자를 장착한 후 안정화를 기다린 후 PSP2(His-Ala-Ser-Tyr-Ser-Cys) 및 PSP2-B5(His-Ala-Ser-Tyr-Ser-Ala- Cys) 용액을 투입한다.(전체 농도 1mg/ml)

수정진동자 금전극표면에 펩타이드 자기조직화 단분자막을 형성 한 후 Milli Q 로 씻어내고 PBS buffer에 넣어 안정화를 기다린다.

20□g/ml∼1000□g/ml 농도의 5,10,15,20-tetrakis(N-methylpyridinium-4-yl) -21H,23H-porphine (H2TMpyP, MW.; 678.8)을 10□l 투입하였을 때의 공진주파수 변화를 수정진동자 분석기(QCA-917, Seiko EG&G)와 컴퓨터를 이용하여 실시간 측정하였다.

포르피린 투입 후 3.4 □g/ml PSP2 coupled Latex-beads 용액을 2□l 식 투입하면서 PSP2-Porphyrin-Latex beads의 sandwich 결합4)에 의해 증폭된 공진주파수 변화를 측정한다.

실험 결과

본 실험에 사용된 펩타이드는 일본 Konam대학 Sugimoto 교수연구팀이 Screening 한 모델로서, 펩타이드의 히스티딘과 티로신의 사이에  포르피린내의 한 개 혹은 두 개의 tryptophan 잔기(殘基)가 들어가게 된다. 이때 히스티딘과 티로신의 tryptophan side chain 거리는 5.4□가 된다.4) 이 모델을 그림 1에 나타내었다.

Fig. 1 Model of interaction between PSP2and H2TMpyP.

그림 2A와 그림 2B는 PSP2와 PSP2-B5를 자기조직화 단분자막을 형성하였을 때와 단분자막을 세척 후 123 □g/ml 농도의 포르피린 투입하였을 때의 공진주파수 변화를 나타낸 것이다. 수정진동자의 주파수 변화는 약 45 Hz와 72 Hz로서 20mm2 의 전극면적에 각각 72 pmol과 98 pmol의 펩타이드 자기조직화막을 형성 한 것으로 계산되어진다. 자기조직화가 끝난 후 새 버퍼용액으로 세척을 하였을 때 약간의 공진주파수 변화를 나타내고 있는데, 이는 단분자막 위에 붙어있던 펩타이드들이 세정하는 동안 떨어져나감으로써 공진주파수의 증가를 가져온 것으로 생각된다.

포르피린 투입 후 공진주파수 변화에서 PSP2-B5의 자기조직화 단분자막에 더 많이 붙는 것을 알 수 있는데, 이것은 히스티딘과 티로신의 부분과 수정진동자의 금전극과의 거리가 좀더 멀어짐으로서 포르피린과의 결합을 위한 공간의 확보가 더 원활해짐으로서 더 많은 결합이 이루어질 것으로 생각된다.

Fig. 2 Frequency response of peptide formation and porphyrin binding

(A; PSP2, B; PSP2-B5)

포르피린 농도변화에 의한 공진 주파수 변화와 Negative control의 물질로 선택한 Ethidium bromide의 농도별 검출 결과를 그림 3에 나타내었다. 포르피린 농도 변화에 대한 공진주파수의 변화에서는 선형적인 결과를 가져왔으나, 수정진동자의 검출한계 및 포르피린과 펩타이드 자기조직화 단분자막 사이의 약한 결합에너지로 인하여 20 □g/ml이하의 농도에서는 검출 할 수 없었다.

Fig. 3 Binding response of the various concentrations of porphyrin

and ethidium bromide on peptide SAM surface by using QCM

PSP2-B5의 경우 PSP2에 비하여 고농도에서의 변화량은 컸지만, 역시 저농도에서는 PSP2와 같은 검출한계농도를 보여주었다.

한편 Negative control의 일환으로 투입한 Ethidium bromide 역시 많은 양의 결합에 기인한 공진주파수의 변화를 가져왔으나, 고농도에서는 Ethidium bromide의 난용성으로 인하여 완전히 용해되지 않은 입자들의 영향이 클 것으로 생각되어진다. 하지만 저농도에서는 van der Waals interaction에 의한 Ethidium bromide의 결합력이 PSP2 혹은 PSP2-B5와 포르피린간의 sandwich 결합력에 비해 약함으로써 공진주파수의 변화가 급격히 저하됨을 관찰할 수 있었다.

결론

H2TMpyP는 이론적으로 62000종류의 펩타이드 sequence와의 결합능력이 있을 것으로 계산되진다. 그중 하나의 모델인 PSP2와 PSP2-B5를 이용하여 히스티딘과 티로신의 2중 trytophan 잔기(殘基)들 사이에 결합하는 포르피린의 농도별 응답변화를 수정진동자를 이용하여 관찰 할 수 있었다.

PSP2 및 PSP2-B5의 자기조직화 단분자막의 형성은 각각 72, 98 pmol이었고, 포르피린의 측정 농도 범위는 17∼615 □g/ml 이었다.

참고문헌

1. J. L. Soret, Compt. Rend., 97, 1267(1883)

2. Shukuro Igarashi, □Studies on porphyrins as ultra-highly sensitive analytical reagents", Bunseki Kagaku, 46(1), 1(1997)

3.. D. S. Karpovich and G. J. Blanchard, □direct Measurement of the Adsorption Kinetics of Alkanethiolate Self-Assembled Monolayers on a microcrystalline Gold surface", Langmuir, 10, 3316(1994)

4. Naoki Sugimoto and Shu-ichi Nakano, Chemistry Letters, 939(1997)