제조용 역상 크로마토그래피를 이용하여 녹차로부터

EGCG의 추출 및 정제

홍 승 범·김 정 일·노 경 호

인하대학교, 화학공학과

Preparative Separation of EGCG from Green Tea

by RP-HPLC

Seung Bum Hong·Jung Il Kim·Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

서론

녹차에는 (+)Catechin ((+)C), (-)epigallocatechin gallate (EGCG), (-)epigallo- catechin (EGC), (-)epicatechin gallate (ECG)와 (-)epicatechin (EC)같은 카테킨 화합물 (GTC)이 포함되어 있다. 카테킨 화합물은 항산화제 및 항암 효과를 지니고 있다(1). 또한 항 혈전적 효과와 카테킨 화합물의 작용 형태가 보고되어지고 있다(2). 카테킨 화합물 중에서 EGCG는 가장 탁월한 항암 효과를 가지고 있다. 특히, EGCG는 담배로 의한 폐암과 피부암에 대해 저해작용을 한다(3,4). EGCG는 Vitamin E보다 25배, Vitamin C보다는 약 100배 정도의 항산화 효과를 가지고 있다(5). 최근에 미국 퍼듀대학 도로시 모어라이와 제임스 모어라이 부부교수팀은 녹차의 EGCG라는 화합물이 암세포 성장에 필요한 효소의 분비를 억제해 암세포를 죽인다는 사실을 입증하여 녹차의 항암 메커니즘을 처음으로 밝혀냈다(6). 그러므로 EGCG와 다른 카테킨 화합물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. EGCG의 화학적 구조식은 C22H18O11이고 명칭은[2R,3R]-2-[3,4,5-Trihy- droxyphenyl]-3,4-dihydro-1[2H]-benzopyran-3,5,7-triol3-[3,4,5-trihydroxybenzoate]이다.

HPLC의 유효성은 분리효율(Resolution)과 분석시간(Speed)에 달려 있다. 제조용 HPLC에서는 또 다른 중요한 요소로써 부하(Load)가 있다(7). 하나의 분리 변수를 최척화하는 것은 다른 분리 변수에도 영향을 미친다. 그러므로 유속을 증가시키면 분리효율을 감소시키는 효과를 나타낸다. 만약, 부하가 너무 많이 걸리면 분리효율이 나빠지게 된다. 즉 컬럼 안의 과부하는 과도한 주입액의 부피나 질량으로 인한 것이다. 부하 용량은 컬럼의 반경과 길이, 충진물의 직경과 밀도에 의존한다. 따라서 높은 순도의 EGCG를 분리하기 위해서는 부하와 압력을 적절히 고려해야 한다. 이번 연구의 목적은 제조용 HPLC를 이용하여 일정용매 조성법의 조건하에 한국산 녹차로부터 EGCG를 분리하는 것이다. 이번 실험에 사용된 제조용 컬럼의 크기는 22×250mm이고, 충진물은 LiChrospher 100RP-18(15□, Merck co.)이다. 이동상은 water, acetonitrile, methanol과 ethyl acetate를 사용하였다.

실험

1. 실험재료 및 기기

본 실험에 사용된 녹차는 전라남도 보성에서 1999년 6월에 재배된 차를 구입하여 사용하였으며, 표준시료 물질인 (／)Catechin((+)C), (-)Epicatechin(EC), (-)Epigallocatechin Gallate(EGCG), (-)Epicatechin Gallate(ECG)는 Janssen Chimica와 SIGMA에서 구입하였으며, Methanol, Acetonitrile, Ethyl acetate은 ACS Grade를 국내에서 구입하였고, Water는 2차 증류한 증류수를 사용하였다.

추출한 시료를 농축하기 위해 회전식 증발기(LABO-THERM SW 200, Resona Technics Co.)를 사용하였다. 분석용 HPLC는 Waters사의 600E, 616 펌프(multisolvent delivery system), 2486 Dual □ absorbance detecter, U6K 주입기(2□ sample loop)를 사용하였고, 데이터 저장 시스템(data acquisition system)은 Millennium32(Waters)를 사용하였다. 제조용 HPLC는 Waters사의 600S, 515 펌프(multisolvent delivery system), 486 UV-visible tunable wavelength absorbance, Rheodyne 주입기(5□ sample loop)를 사용하였고, 데이터 저장 시스템은 Chromate(Ver. 3.0 Interface Eng.)을 사용하였다.

2. 추출, 정제 및 분석

국내에서 재배된 녹차 5g에 순수한 물 150□를 넣고 50℃, 300rpm, 4시간동안  교반기에서 교반하여 추출을 하였다. 추출이 끝난 추출액은 10분동안 원심분리(4000rpm)한 후, 여과하여 rotary evaporator를 사용하여 60℃이하에서 농축하였다. 농축액에서 불순물을 제거하기 위해 chloroform을 이용하여 1:1(vol. %)로 분배한 후, 물층을 다시 ethyl acetate를 이용하여 1:1(vol. %)로 분배하였다.

분석용 RP-HPLC의 컬럼(3.9×300mm)과 제조용 컬럼(22×250mm)는 15□로 충진 되었다. 이동상은 acetic acid가 0.1% 포함된 water, acetonitrile, methanol과 ethyl acetate가 사용되었다. 분석용 HPLC에서의 유속은 1.0□/min, injection volume은 20□이고, 제조용 HPLC에서는 각각 16ml/min, 400□이다. Detecter UV는 280nm이고 실온에서 실험하였다.

결과 및 고찰

녹차에 함유되어 있는 카테킨 화합물을 추출하기 위하여 순수한 물 50℃에서 300rpm으로 4시간동안 추출을 하고, 불순물을 제거하기 위해 chloroform과 ethyl acetate로 분배하였다. 분배를 통한 추출과정은 제조용 컬럼을 사용하는 정제과정에서 순도를 높이기 위해 필요한 과정이다(8).

Figure 1에서는 제조용 컬럼으로 이동상 조성을 water/acetonitrile/methanol, 70/14/16 vol.%, 으로 하여 추출물을 분석한 크로마토그램이다. 전체적으로 retention time이 빨라지긴 했지만, EC와 EGCG가 7∼10분 사이에 같이 용출되었다. Figure 2에서는 methanol 대신 ethyl acetate를 사용하여 분석을 실시한 결과이다. 이때의 이동상의 조성은 water/acetonitrile/ethyl acetate, 80/18/2 vol.%이다. Retention time이 느려지긴 했지만, 다른 카테킨 화합물로부터 EGCG가 분리되었다. 9∼12분 사이의 용출액을 4번 collection하여 4□로 농축하였다.

Figure 3은 EGCG를 확인하기 위하여 15□ packing으로 농축액을 분석한 크로마토그램이다. 이때의 이동상의 조성은 Fig. 2와 같고 유속은 1ml/min이다. (+)C와 EC가 EGCG보다 먼저 용출되었으며 순도가 97%인 EGCG를 얻을 수 있었다.

알림

본 연구는 Bioseparation Technology Research Center(BioSeTeC)의 지원에 의하여 고순도 분리 연구실에서 수행되었으며, 이에 감사드립니다.

참고문헌

1. Masami Suganuma, Sachiko Okabe, Naoko Sueoka, Eisaburo Sueoka. Satoru     Matsuyama, Kazue Imai, Kei Nakachi, Hirota Fujiki, Mutation Research,      428, 339 (1999).

2. W. S. Kang, I. H. Lim, D.Y. Yuk, K. H. Chung, J. B. Park, H. S. Yoo and     Y. P. Yun, Thrombosis Research, 96, 29 (1999).

3. Chung F.-L., Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 220, 244 (1999).

4. S. P. Stratton, R. T. Dorr, D. S. Alberts, European J. of Cancer, 36, 1292     (2000).

5. N. Ahmad, DK. Feyes, AL. Nieminen, R. Agarwal, H. Mukhtar, J. of the Natl. Cancer Inst., 89, 1881, (1997).

6. D. J. Morre et al., Proceedings of the American Society for Cell Biology,     38th Annual Meeting, USA, San Francisco (1998).

7. K. Hostettmann, A. Marston, M. Hostettmann, Preparative Chromatography     Techniques, 2nd ed., Springer, 1997, p. 50

8. S. T. Chung, K. H. Row, J. H. Kang, and Y. K. Park, pending to Korean      patent, 42877, (1998).

Fig. 1 Chromatogram of extract of Korean green tea (Preparative column (22×250mm), Water/ACN/MeOH, 70/14/16 vol.%, inj. volume : 400□, 16ml/min)

Fig. 2 Chromatogram of extract of Korean green tea (Preparative column (22×250mm), Water/ACN/EA, 80/18/2 vol.%, inj. volume : 400□, 16ml/min)

Fig. 3 Chromatogram of extract of Korean green tea (Analytical column (3.9×300mm), Water/ACN/EA, 80/18/2 vol.%, inj. volume : 20□, 1ml/min)