Membrane Chromatography에 의한 Oligomers의 분리특성

홍 승 범·김 정 일·선 향*·노 경 호

인하대학교, 화학공학과

*기술표준원, 섬유과

Separation Characteristics of Oligomers

by Membrane Chromatography

Seung Bum Hong, Jung Il Kim, Hyang Sun*, Kyung Ho Row

Dept. of Chem. Eng., Inha University, Inchon 402-751, Korea

*Agency for Technology and Standards. MOCIE

서론

분리기술은 혼합물을 신속하고, 고순도로 정제하는 것이 중요하다. 다양한 분리기술 중에서 관심을 모으는 것이 크로마토그래피이다. 크로마토그래피 기술은 혼합된 시료성분이 이동상과 고정상 사이를 흐르면서 흡착작용, 분배작용, 이온 교환작용, 또는 분자크기, 배제작용 등에 의해 각각의 단일성분으로 분리되는 것으로 성분의 정성 및 정량의 분석 목적과 정제, 분리 등의 분취 목적에 이용된다.[1] 그 중 한 분야로 High- Performance Membrane Chromatography (HPMC)는 최근 들어 많은 연구가 진행되고 있는 크로마토그래피의 기술 중에 하나이다. 특히 액체 크로마토그래피와 membrane의 혼합공정은 생 고분자물질의 분리와 정제에서 탁월한 효과가 있다. 현재 가장 효율적인 HPMC 분리 기술에서 사용하고 있는 membrane의 형태는 미세공 조직을 가진 평막(flat sheet)과 중공사막(hollow fiber), membrane stacks, radial flow cartridge로 분리되고 이들을 고정상(stationary phase)으로 사용한다. 분리의 메카니즘은 affinity interaction, ion exchange, hydrophobic interaction and reversed-phase, multistage chromatography이다.[2] Membrane은 세공크기와 흡착에 의한 물질의 분리가 이루어지는 반면 기존의 High-Pressure Liquid Chromatography (HPLC)에서는 컬럼에 충전된 흡착제와 이동상간의 확산, 입자사이의 흡착과 탈착의 메커니즘으로 분리가 되는데 상용되는 흡착제의 대부분은 다공성 입자이다. 큰 흡착능력, 큰 표면적이 좋기 때문에 결과적으로 미세한 구멍이 많이 필요하다. 흡착질 분자는 흡착제 입자 밖에서 들어오고, 입자 안쪽으로 확산되어 사용할 수 있는 흡착자리를 가득 채운다. 흡착제 구조에 의존하는 확산메커니즘의 몇몇 다른 형태가 지배적이 되고 때때로 둘 또는 세 가지가 경쟁적으로 흡착한다. 그 지배적 메커니즘은 또한 흡착제와 흡착질의 조합과 온도, 농도 범위 같은 흡착조건에 의존한다. 이러한 이유 때문에 분리시간이 길어지고 높은 압력에서 분리가 된다. 그러나 HPMC에서는 흡착제의 작용과는 구별되는 얇은 막을 통해서 쉽게 물질전달이 되므로 분리시간을 단축할 수 있고 낮은 압력으로 분리가 가능하다.[3] HPMC의 주요응용 분야로는 단백질 정제와 의학분야 이다. HPMC의 장점은 다음과 같다.

(1) 큰 규모에서의 생물학적 분자들을 몇 분 안에 분리할 수 있다.

(2) 유속의 영향이 작고 높은 분리도(high resolution)를 가질 수 있다.

(3) 매우 높은 유속에서도 낮은 압력(low pressure drop)을 갖는다.

(4) 장치를 scale-up하기가 쉬우며, 분석용 CIM□disks와 같은 물질로 구   성된 튜브로 정제와 모니터링 프로세스가 비슷한 조건하에서 가동이   가능하다.

(5) 기존의 LC/HPLC system과의 호환성(compatibility)이 좋다.

(6) 조작이 간편하다.

Membrane의 원리와 응용

Membrane chromatography에서 가장 중요한 요소 중의 하나는 고정상으로 사용되는 membrane 지지체의 선택문제 이다. 효과적인 분리를 위해서는 미세공막과 작용기를 결합하는 방법을 연구하는 것이 중요하다. 현재 사용되고 있는 membrane 지지체의 종류는 flat sheet, membrane stacks, radial flow cartridge, hollow fiber 등이 있다.

컬럼으로 사용되는 membrane의 제조는 두 단계로 이루어진다. 지지체를 화학적으로 활성화시키는 것과 활성화된 지지체에 리간드를 결합시키는 것이다. Matrix의 활성화 부분에 결합된 물질은 그 지지체 자체의 성질과 안정성에 의해서 결정된다. 리간드를 고정화시키는 방법은 지지체위에 직접 리간드를 결합시키는 것과 효과적으로 리간드를 결합시킬 수 있는 spacer group을 지지체에 결합시키는 것이다. Membrane을 활성화시켜 리간드를 결합시키는 방법은 일반 크로마토그래피에서 사용되는 충진컬럼에서 사용되는 방법과 동일하다.

Membrane chromatography의 생물학적 분자를 흡착 분리하는 메카니즘은 다음과 같다. 이러한 응용분야는 흡착에 대한 리간드의 화학적 성질에 따라 분류할 수 있는데 첫 번째로 고려할 것은 affinity 분리에 의한 것으로서 biospecific, dye ligand, immobilized metal, pseudo-affinity adsorption등이 있다. 두 번째로는 이온 교환을 할 수 있는 양이온 또는 음이온 교환 리간드를 가지고 있는 ion-exchange membrane을 사용하여 분리하는 방법이 있다. 세 번째는 반데르 발스힘이나 hydrophobic interaction에 의한 membrane 흡착에 의한 분리방법이고 마지막 네 번째는 이들 세가지 분리 방법을 조합한 multi-stage 분리 방법이 있다.

최근에는 유전 및 생명공학에 의한 제품들에 대한 분리, 정제의 방법으로서 연구가 진행중이다. 그밖에 peptides, oligonucleotides와 polynucleotides 분자들의 정제와 분리, solid-phase extraction, biosensors, bioconversions등에 대한 분야에서 응용되고 있다. 현재 사용되고 있는 막의 분리기능은 대부분 물리적 기능이다. 따라서 그 분리 정도가 낮다. 일반적인 화학 분리 공정에서 물리적인 분리 방법은 분리 인자 (separation factor)가 2-4정도인데 반해 화학적 분리법은 10-30정도이며 생물학적인 분리 방법은 100-수천에 이른다. 따라서 분리도를 높이기 위해서는 막에 화학이나 생물학적인 분리가능 방법을 도입하는 것이 필요하게 되었다. 그래서 현재 응용되고 있는 것이 membrane chromatography 이다.

실험

1. 시약 및 기기

본 실험에 사용된 oligodeoxynucleotides는 Sigma에서 구입하였고 oligodeoxynucleotide 8(oligo 8), C CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 10(oligo 10), GTC CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 12(oligo 12), AC GTC CAT GTC T3'; oligodeoxynucleotide 14(oligo 14), C GAG GTC CAT GTC T3'를 사용하였다. 이동상은 Tris-HCl(pH7.4)과 NaCl을 사용하였다. 고정상으로는 직경이 16mm, 두께가 3mm인 Monlithic Convective Interaction Media(CIM) DAEA disk 사용하였고, HPLC는 Waters사의 600E 펌프(multisolvent delivery system), 490 UV-visible tunable wavelength absorbance, 260nm, Rheodyne 주입기(50□ sample loop), 데이터 저장 시스템은 Chromate(ver. 3.0, Interface Eng.)를 사용하였다.

2. 방법

본 실험에서는 CIM DEAE(diethylaminoethyl) disk를 고정상으로 하고 이동상은 buffer A(20mM Tris-HCI, pH 7.4)와 buffer B(buffer A + 1M NaCl)를 사용하였다. Injection volume은 10□, 유속은 4, 6 □/min이며 실온에서 실험하였다.

결과 및 고찰

Fig. 1에서는 oligodeoxynucleotide를 일정용매 조성법 (isocratic elution)을 사용한 것으로 8, 10, 12mers는 분리되었지만 14, 15, 16mers가 함께 용출되었다. 일정용매 조성법으로 분리가 잘 되지 않았기 때문에 Figs. 2, 3에서 y2축에서 보는 바와 같이 buffers A, B를 구배용매 조성법 (gradient elution)으로 oligomers를 분리하였다. 이때의 유속은 6ml/min이고 구배용매 조성법에서는 일정용매 조성법보다 oligomers의 분리도가 크게 개되었지만 14, 15, 16 mer의 분리 효율이 좋지 않았다. Fig. 3에서는 Fig. 2와 같은 조건의 구배용매 조성법을 사용하고 유속을 4ml/min으로 낮추어 olgomers를 분리하였다. 각 oligomer에 대한 체류시간 (retention time)은 길어졌지만 분리도는 향상되었다.

알림

본 연구는 인하대학교 고순도 분리연구실에서 수행하였으며 기술표준원 산업기반 연구개발의 지원에 감사드립니다.

참고문헌

1. 노경호 □액체 크로마토그래피의 원리와 응용□, 인하대학교 출판부(1999)

2. Xianfang Zeng, Eli Ruckenstein, Biotechnol. Prog., 15,1003(1999)

3. Ales Podgornik, Tatiana Tennikova, Anal. Chem., 71,2986(1999)

Fig. 1 Isocratic separation of oligodeoxynucleotides using CIM DEAE.

(mobile phase ; buffer A of 20mM Tris-HCl, buffer B of 1M            NaCl in buffer A, 6ml/min flow rate)

Fig. 2 Gradient separation of oligodeoxynucleotides using CIM DEAE.

(6ml/min flow rate)

Fig. 3 Gradient separation of oligodeoxynucleotides using CIM DEAE.

(4ml/min flow rate)