질량분석기를 이용한 미지 생리활성물질의 구조분석

김진영, 김영환, 유종신

기초과학지원연구소 중앙분석기기부 질량분석그룹

Mass Spectrometry for the Structural Identification of Biologically Unknown Active Materials

Jin Young Kim, Young Hwan Kim, and Jong Shin Yoo

Mass Spectrometry Group, Korea Basic Science Institute

서론

생체유용물질의 구조분석을 위한 질량분석법중 가장 대표적인 것으로 고속원자 충돌법(Fast Atom Bombardment; FAB), 매트리스-보조 레이저 탈착 이온화법 (matrix-assisted laser desorption/ionization; MALDI)과 전기분무이온화법(electrospray ionization; ESI)을 들 수 있다. 세 가지 모두 미지생체분자를 이온화시키고 기화시킴으로써 생리활성 물질의 구조규명에 지대한 기여를 하였다

FAB 방법은 시료를 액체 매트릭스와 혼합하여 질량분석기 안에서 고속원자와 충돌시켜 이온화 한다. 그리고 탄뎀질량분석기를 이용하여 고 에너지 충돌실험을 하면 미지 생리활성물질의 구조규명시 분자량 정보와 구조적 정보를 알 수 있다. 매트릭스의 간섭에 의해 검출하한이 높으므로 시료가 충분할 경우 구조분석에 유용하다. 이에 비해 MALDI는 시료 중에 존재하는 불순물에 크게 영향을 받지 않으며 시료준비가 간편하고 스펙트럼이 분자량만을 나타내므로 혼합물 측정에 유리하다. 한편 ESI 방법은 시료를 용액 상태에서 곧바로 이온화시키기 때문에 정량분석이 가능하며 HPLC등의 분리과정과 온라인 연결이 용이하다. 따라서 생리활성 물질의 분리및 분석을 동시에 행할 수 있으며 LC/UV와 같이 화합물의 순도를 검증할 수 있다. 그리고 생리활성물질등의 제조공정시 공정관리가 가능하며 적은 양의 미지 분순물을 동시에 분리 확인할 수 있다.

FAB방법은 지방산1-3 펩티드4,5, 당6-8, 항생제9, 그리고 당지질10,11과 같은 생체 물질의 구조 연구에 널리 이용되어 왔다. 그 예로 조혈모세포의 활동을 촉진시키는 생리활성 물질인 트리아실글리세롤(triacylglycerols: TAGs)의 구조를 분석하기 위해 질량분석기를 포함한 많은 분석방법이 사용되었다.12,13 한편, 당지질과 인지질에 대해 고속원자충돌법에 의해 생성된 나트륨 부착이온의 충돌유발분해반응이 이러한 물질들의 구조를 분석할 수 있는 매우 유용한 정보를 제공한다.14,15

한편 ESI방법은 액체크로마토그래피와 연결된 고분해능 질량분석기를 통해 항생제등의 구조를 밝히는 방법으로 사용할 수 있다. 항생제중 시료 내 포함된 불순물의 순도 및 극미량 미지화합물의 구조분석을 통하여 생리활성 항생제의 Quality Control에 이용된다. 그중 Cephalosporin 계열 항생제는 □-Lactam 계열의 항생제로 그램양성과 그램음성 병원균에 대한 항균성이 크기 때문에 박테리아 감염에 의한 전염병 치료에 널리 사용되는 항생제이다. Cephalosporin 계열 항생제는 pH, 용매조건, 열 등에 약하기 때문에 치료제로써의 활성을 쉽게 잃어버릴 수 있으므로 이들 화합물의 보관 과정에서 일부 변형된 화합물이 포함되거나, 제조과정 중 유입되는 경우가 있으므로 그 양을 확인하고 구조를 밝혀내는 일이 중요하다. 이에 따라 본 실험에서는 cephalosporin 계열의 항생제 중 ceftiofur를 선택하여 모세관 액체크로마토그래피와 온라인으로 연결된 고분해능 질량분석기를 통해 내부표준물질을 이용하는 방법으로 정확한 분자량을 확인하였으며, 그 구조적 특성 및 미량으로 포함된 변형된 미지화합물의 구조를 밝히는 방법을 연구하였다.

실험

모노아세틸디글리세라이드의 구조는 그림 1에 보여진다. 소 가슴살을 잘게 갈아 증류수로 씻고 다시 phosphate saline 용액 (PBS, pH 7.4)으로 씻어낸 후 CHCl3-MeOH 2:1 (v/v)용매하에서  균일화한다. 4℃에서 밤새 방치한 후 5000 rpm에서 30분 동안 centrifuge한다. 클로로포름층의 상등액을 감압하에서 농축시켜 63.4g의 지질 혼합물을 얻었다. 결과적인 residue는 hexane-diethyl ether 4:1 (v/v)의 eluent를 이용한 silica gel 컬럼 크로마토그라피에 의해 분리되어 모두 8개의 분획으로 나누어진다. 이 분획을 hexane-ethyl acetate 9:1 (v/v)을 이용한 silica gel 컬럼 (35 cm x 1.3 cm I.D.) 크로마토그래피로 한 단계 더 분리한다. 그렇게 해서 얻어진 다섯 개의 분획 중 세 번째를 hexane-ethyl acetate 20:1 (v/v)를 이용해 silica gel 컬럼상에서 반복적으로 분리하여 모노아세틸디글리세라이드(6.5mg)를 추출하였다.

Figure 1.

Structures of  monoacetyldiglycerides

FAB 질량분석법은 E1B1E2B2 배치를 가진 four-sector 기기인 JMS-HX110/110A 탄뎀질량분석기를 사용하여 수행하였다.9 이온원은 분해능이 1000(10% valley)인 양이온 모드에서 10kV 가속전압을 사용하였다. 이온들은 22kV로 고정된 Cs+ 이온총을 사용한 고속원자충격법에 의해 생성되었다. 각 시료의 약 10□을 클로로포름/메탄올(1:1, v/v)에 녹인 후 1□l을 취해 NaI로 포화된 혹은 그렇지 않은 3-nitrobenzyl alcohol 1□l와 FAB probe tip 위에 놓고 섞는다.  충돌가스인 헬륨을 충돌실에 주입하여 전구 이온의 세기가 70%정도 줄어들도록 충돌실 압력을 유지한다. CID스펙트럼은 두 번 주사하여 얻은 signal을 평균하여 얻는다. MS-1은 전구이온의 12C-species만이 지나가도록 분해능을 조절한다. 한편, MS-2의 분해능은 1000에 고정되었다.

액체크로마토그래피는 정지상으로 Capillary C18칼럼을, 이동상으로는 이온화가 잘 될 수 있도록 물과 아세토니트릴의 혼합 용매를 기울기용리법으로 사용하였으며 분자량 이온의 감도를 높이고 분리 효율을 높이기 위해 소량의 formic acid를 첨가하였다. 시료를 HPLC로 분리한 후 [M+H]+ 이온으로 분자량 피크를 확인하였다. 그리고 nozzle voltage를 증가시키는 이온화원 충돌유발반응으로 질량스펙트럼을 얻었다. 모든 화합물은 분자량이온에 대해 고분해능 질량 분석기로 내부표준물질을 사용하여 측정된 실험값과 예상된 구조에서 계산된 이론값을 비교하였다.

결과 및 토론

FAB을 이용하여 소 가슴에서 추출한 MADGs의 구조 분석은 추출물내에 여러 성분의 MADGs가 존재함을 알 수 있다. 그 중의 하나인 m/z 659 이온의 탄뎀 CID 질량스펙트럼으로부터 두 쌍의 G 그리고 3I 이온들로 그 성분은 C18:1과 C16:0(palmitoyl) 그룹을 두 지방산으로 가지고 있음을 알 수 있다. 또한, C18:1 지방산 사슬을 따라 고 질량 영역에서 m/z 643, 629, 615, 601, 587, 573, 559, 545, 533, 519, 505, 491, 477, 463, 그리고 449 (3I1)에 일련의 동족 이온들을 생성시킨다. 이들의 스펙트럼 분석을 통해 C18:1 지방산은 oleoyl기로 확인된다. 다른 성분들에 대한 결과는 표 1에 요약되었다. m/z 577, 631, 그리고 657에 관측되는 각각의 성분들은 다른 지방산 조성을 가진 두 component의 혼합물임을 알 수 있다.

표 1. Structural identification of monoacetyldilglyceride (MADG) molecular species isolated from bovine udder.

MW	[M+Na]+	Structure of two fatty acyl groupsa
554.4 582.4 608.4 610.4 634.5 636.5 638.5 660.5 662.5 664.5	577.4 605.4 631.4 633.4 657.5 659.5 661.5 683.5 685.5 687.5	C16:0/C12:0+C14:0/C14:0 C16:0/C14:0 C18:1/C14:0+C16:0/C16:1 C16:0/C16:0 C18:2/C16:0+C18:1/C16:1 C18:1/C16:0 C18:0/C16:0 C18:1/C18:2 C18:1/C18:1 C18:0/C18:1

a The fatty acyl groups of Individual molecular species of MADG are symbolized by the convention, carbon number:double bond number (i.e., C12:0 (lauroyl), C14:0 (myristoyl), C16:0 (palmitoyl), C18:1 (oleoyl), C18:2 (linoleoyl)).

한편 ESI는 HPLC 용리액을 분무 (nebulization)와 전기이온화 (charging)를 통해 전하를 띤 작은 물방울로 만들고, 탈용매화 (desolvation) 과정을 거쳐 이온을 생성시킨 후 질량분석기 안으로 유입시킨다. 한편 ESI를 통해 생성된 이온은 이온화 장치내부에서 충돌반응을 유발시켜 (in source fragmentation) 분해 이온을 만들고, 이로부터 구조적으로 유용한 정보를 얻을 수 있게 된다.

□-Lactam 고리를 가지는 항생제 화합물인 penicillin과 cephalosporin은 공통적으로 □-Lactam 고리가 깨지면서 각각 특정 분해 이온을 생성하므로 이로부터 □-Lactam 고리의 존재 여부와 구조의 변화를 알 수 있게 된다. ceftiofur 시료에는 ceftiofur (MW=523) 이외에 미지의 분자량 455, 617의 화합물을 확인 할 수 있다. 이들 화합물에 대해 충돌유발반응 시킨 후 얻은 질량스펙트럼에서는 ceftiofur를 비롯하여 모든 경우에 [M+H]+의 분자량이온과 함께 구조적 특징을 나타내는 몇몇 생성이온들을 볼 수 있다.  분자량 455인 화합물은 m/z 396 이하에서 발견되는 대부분의 분해이온들이 ceftiofur의 경우와 일치하므로 ceftiofur와 매우 유사한 구조를 가졌음을 알 수 있다. 분자량 617의 화합물은 분해이온의 크기가 분자량이온에 비해 작지만 분자량이온과 각각 m/z 305와 350 이상의 분해이온들이 ceftiofur와 유사한 분포를 보이고 있다. 이는 C3위치의 치환체를 포함한 ceftiofur의 구조가 기본적으로 남아있고 일부분이 첨가되었음을 나타낸다.

모든 화합물은 분자량이온에 대해 질량분석기로 얻은 실험값과 예상된 구조에서 계산된 이론값을 비교하여 5ppm 이하의 오차범위에서 원소조성이 일치함을 보였다. 따라서 capillaryLC/ESI/TOF-MS를 이용하여 cephalosporin  계열의 항생제인 ceftiofur를 분석하고 미량으로 혼합되어 있는 불순물의 구조를 질량스펙트럼을 통해 확인 할 수 있었다. 각각의 화합물에 대해 □-Lactam 고리를 포함한 7-amino cephalosporanic acid의 분해와 아민기, 아세틸기, 카르복시기, 메톡시기 등의 추가적 작용기 이탈에 의한 특정 피크를 관찰함으로써 구조 변화가 확인되었다. Ceftiofur의 경우  cefotaxime에 비해 □-Lactam 고리의 분해가 쉽게 일어나지만 C3 치환체는 비교적 안정적인 것이 특징적이었고, cefotaxime은 □-Lactam의 분해에 의한 생성물보다는 C3 치환체인 side chain의 변형과 분해에 의한 생성물들이  주로 관찰되었다. 그리고 두 화합물 모두 제조과정 중 과량으로 유입된 반응시약에 의한 부가적 반응으로 생긴 불순물들로 확인되었다.

결론

중요한 생화학적 작용을 가진 생체에서 추출된 미지 MADGs의 구조가 FAB-CID-MS/MS에 의해 분석되었다. 나트륨이 부착된 이온의 고 에너지 CID 스펙트럼은 지방산 조성 그리고 지방산내의 이중결합의 위치 뿐만 아니라 두 지방산의 상대적 위치에 관한 정보를 담고 있다. 또한 Capillary LC/ESI/TOF-MS를 이용해 항생게의 미량혼합 불순물들을 분리하고 동시에 구조를 확인할 수 있었으며, 고분해능 질량분석기를 통한 분자량 측정으로 예상된 구조 확인에 중요한 정보를 제공할 수 있었다. 이러한 방법들은 생체물질 중 혼합물상태로 미량 존재하며, 여러 조건에 불안정하여 분석이 어려웠던 다른 미지시료에도 적용할 수 있을 것으로 예상된다.

참고문헌

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