Xanthium strumarium으로부터 8-epi-tomentosin의 최적 생산 조건

박재성1, 남민희2, 박선호1

1계명대학교 공과대학 화학공학과, 2농촌진흥청 영남농업시험장

Optimal Conditions for the Production of 8-epi-tomentosin

by Xanthium strumarium

Jae Sung Park1, Min Hee Nam2, Sun Ho Park1

1School of Chemical and Materials Engineering, Keimyung University,

Taegu 704-701, Korea

2National Teongnam Agricultural Experiment Station, RDA,

Milyang 627-130, Korea

서론

식물에서 생산되는 유용물질들은 의약품, 향신료, 방향제, 색소, 살충제 및 고순도 화학제품 등 여러 가지 용도로 사용되고 있으며 그 규모는 전세계 의약품 시장의 25%에 달하고 있다.  그러나 생화학물질의 생산에 있어 식물을 재배하고 추출, 정제하는 것은 지리적, 기후적, 재배환경등의 변화에 많은 제약이 있어 이를 극복하기 위해 조직배양 및 세포배양기술을 이용한 식물세포배양 연구가 활발히 진행되고 있다. 국화과(Compositae)에 속하는 도꼬마리(Xanthium strumarium)는 한국, 일본, 아시아, 유럽 등지에 분포하는 한해살이 풀이다. 열매를 말린 것은 창이자라 하며 이는 해열, 발한, 진통, 산풍, 거습, 궤양성 피부병, 신경통, 천연두 및 악성 종양에 효과가 있으며(1), 항균효과로는 티푸스군, 이질균, 황색 포도상 구균에 저해효과가 있다(2). 창이엽에는 거풍습, 진통, 해열, 살충 등 다양한 효능이 있으며(3). 뿌리는 강장제, 갑상선, 암에 효과가 있으며(4), 줄기는 저혈당증을 유발하는 것으로 보고되고 있다(5). 또한 최근 국화과에 속하는 식물체에서 생산되는 유용물질인 sesquiterpene lactone은 antimalarial, antipsoriasis, anti-inflammatory, anti-bacterial 등에 효과를 보이며, Xanthium strumarium 식물체에서는 sesquiterpene lactone에 속하는 Xanthanolide중 xanthumin, xanthatin, 8-epi-tomentosin 등이 생산된다고 보고되고 있다(6). 그러나 도꼬마리에 대한 조직배양 및 식물세포배양연구는 아직 미흡한 실정이며 단지 고체배지에서 생장조절제별로 callus 유도실험이 보고된 정도이다(7).

본 연구에서는 Xanthanolide계 유용물질중에서도 도꼬마리 식물세포의 부위별로 선발된 세포주를 사용하여 식물세포배양에 의한 8-epi-tomentosin의 최적 생산 조건을 검토하였다.

실험재료 및 방법

1. 세포주 선발

한국산 도꼬마리(Xanthium strumarium)의 종자를 성주에서 채취하여 MS(Murashige and Skoog) 고체 배지에 25℃, 암조건으로 배양하여 식물체를 얻었다. Callus는 MS 고체 배지상에서 25℃, 암조건으로 생장조절제 NAA 2ppm+BA 2ppm +ABA 1ppm를 첨가하여 각 부위에서 유도되었으며, 현탁배양은 B5 배지를 사용하여 100 mL 삼각 flask에서 20 mL working volume으로 세포를 배양하였다. 생장조절제는 NAA 2ppm+BA 2ppm+ABA 1ppm을 첨가하였으며 배양 조건은 25℃, 명배양실에서 회전식 shaker로 110rpm으로 운영하였다. 세포 농도는 dry cell weight를 측정하였으며 dry cell weight는 세포들을 증류수로 2차례 세척 후 60℃ 건조기에서 24시간 이상 건조한 다음후 측정된 무게를 사용하였다.

2. 8-epi-tomentosin 생산성 확인

자엽과 배축부위에서 세포주를 선발하여 유용물질인 8-epi-tomentosin의 생산성 여부를 확인하기 위해 천연물로부터 분리된 표품을 이용하여 TLC(silica gel 60, Merck)와 HPLC(Hitachi L-4250, C18 column, UV 254nm)로 분석하였다. 샘플의 준비는 배양 8일된 상등액을 사용하여 chloroform 1.5배액으로 조추출하여 사용하였다.

3. Flask상에서 세포 성장 및 8-epi-tomentosin 생산의 최적화

자엽부위에서 선발된 세포주를 사용하여 100 mL flask에서 20 mL working volume으로 B5배지에서 세포를 배양하였으며 flask상에서 세포성장 및 8-epi-tomentosin 생산성 최적화를 수행하기 위해 3종류의 실험이 수행되었다. 첫 번째는 초기접종농도 변화 실험으로 초기접종농도를 3 mL(15%), 6 mL(30%)로 접종하여 배양하였으며, 두 번째 탄소원의 종류에 따른 실험에서는 탄소원으로 casein acid, hydrolysate 2 g/L, coconut water 2 mL/L, banana extract 2 g/L를 첨가하여 배양하였고 세번째 sucrose 농도 변화 실험에서는 sucrose 농도를 20, 40, 60 g/L로 첨가하여 이때의 세포성장과 8-epi-tomentosin 생산성 변화를 측정하였다. 세포의 성장은 dry cell weight를 사용하여 측정하였으며, 8-epi-tomentosin 농도는 chloroform 1.5배액으로 조추출후 HPLC를 사용하여 측정되었다.

결과 및 고찰

Xanthium strumarium의 식물체에서 선발된 세포주들중 대표적으로 자엽부위의 세포주를 Fig. 1에 나타내었다. 선발된 세포들은 서로 뭉쳐(aggregation) 배양되는 경향이 있었으며, 배양기간은 8일정도로 비교적 빠른 세포성장을 보였다.

자엽과 배축부위의 세포주에서 8-epi-tomentosin이 생산되는지의 여부를 TLC로 정성 분석한 결과, Rf치가 5.78인 값에서 밴드가 나타났으며, HPLC로 정량 분석한 결과, 자엽부위 세포주에서 8-epi-tomentosin 최대 농도가 13.36 mg/L로 생산됨을 확인되어 자엽부위가 배축부위보다 8-epi-tomentosin의 생성능이 좋은 것으로 나타났다.(data not shown)

Flask상에서 자엽부위 세포주를 사용하여 세포 성장 및 8-epi-tomentosin 생산 최적화 실험을 수행하였다. 우선 시간의 경과에 따른 세포 성장 및 8-epi-tomentosin 생산성을 보면 세포의 성장은 최대치에 도달할 때까지 계속적으로 증가하다가 11일경 최대치에 도달한 후 성장이 감소하며, 유용물질인 8-epi-tomentosin도 세포 성장에 비례하여 증가하다가 9일 이후에는 감소하는데 이는 세포 성장과는 조금 다른 경향을 보이며 세포가 최대치에 도달하기 전에 8-epi-tomentosin은 감소함을 보여 9일 이후에는 8-epi-tomentosin 생산이 세포내에 축적될 뿐 배지로는 배출되지 않기 때문으로 사료된다.  초기접종농도를 변화시켰을 때 세포성장 및 8-epi-tomentosin 생산성에 미치는 영향을 Fig. 1에 나타내었다. 세포의 성장은 세포 농도에 비례하여 성장함을 볼 수 있으며 성장속도는 세포접종농도에 비례하여 나타났다. 또한 10일 전후까지는 세포의 성장이 이루어지나 10일 이후에는 배지내에 갈변현상이 일어나 세포의 사멸이 이루어짐을 확인하였다. 8-epi-tomentosin 생산성은 초기접종농도를 3 mL 첨가시에는 7 mg/L로 측정되었으나, 6 mL 첨가시에는 4 mg/L로 측정되어 초기접종농도가 증가되면 8-epi-tomentosin의 생산성은 감소함을 관찰할 수 있었으며 이는 세포 성장이 유용물질의 생산성과 관련이 있음을 보여주는 결과이다.

탄소원의 변화에 따른 세포 성장 및 8-epi-tomentosin 생산성의 변화는 Fig. 2에 나타내었으며, coconut water를 첨가하여 배양한 경우가 casein acid, hydrolysate를 첨가하여 배양한 경우보다 세포의 성장이 좋으며 그 최대 농도는 26.5 g/L로 나타났으며 banana extracter를 사용하여 배양한 경우에는 세포이 성장이 이루어지지 못하고 배양 초기부터 갈변현상이 나타났다. 8-epi-tomentosin 생산성은 coconut water와 casein acid, hydrolysate를 사용할 경우 모두 7 mg/L의 최대 생산량을 나타내었으며 coconut water를 첨가하였을 경우 maximum에 도달하는 시간이 casein acid, hydrolysate보다 이틀정도 빠름을 관찰할 수 있었다.

Sucrose를 농도별로 첨가한 경우에는 세포의 성장이 sucrose의 첨가 농도가 증가할수록 세포의 성장도 좋아졌으며 그 최대 농도는 sucrose 60 g/L 첨가시 34.5 g/L로 나타나 배지내 sucrose 농도가 증가하면 당 성분의 고갈현상의 해소로 세포의 성장이 증대됨을 알 수 있었다.

참고문헌

1. Chopra, R.N., Chopara, I.C., Handa, K.L. and Kapur, L.D.: Indigeous Drugs of

India, 2nd Ed., U. N. Dhar and Sons, Calcutta, p438 (1958).

2. Lee, D.B.: Economic Plants, 15, p 423 (1974).

3. Talakai, T.S., Dwivedi, S.K. and Sharma, S.R.: Journal of

Ethnopharmacology, 49, 141-145 (1995).

4. Mukherji, S., Banerjee, A.K. and Mitra, B.M.: Indian Journal of Pharmacy,

32, 48-49 (1970).

5. Dhar, M.L., Dhar, M.M., Dhawan, B.N., Mehrotra, B.N. and Ray, C.: Indian

Journal of Experimental Biology, 6, 232-247 (1968).

6. Ahn, J.W., No, J.S., Ryu, S.Y., Zee, O.P. and Kim, S.K.: National Product     Sciences, 1(1), 1-4 (1995).

7. Ellis, J.P. and Camper, N.D.: Journal of Plant Growth Regulation, 14, 9-13     (1995)

Figure 1. Status of suspension cells were cultured from plant of Xanthium Strumarium. The suspention cells were cultured at 25℃ under light condition.

Figure 2. Effect of cell growth and 8-epi-tomentosin productivity by variety of   initial inoculation concentration. (●) cell growth at 3mL inoculation, (■) cell growth at 6mL inoculation, (○)  8-epi-tomentosin productivity at 3mL inoculation, (□) 8-epi-tomentosin productivity at 6mL inoculation.

Figure 3. Effect of carbon sources on cell growth and 8-epi-tomentosin production. (●) cell growth with 2 g/L casein acid, hydrolysate, (■) cell growth with 2 ml/L coconut water, (○)  8-epi-tomentosin production with 2 g/L casein acid, hydrolysate, (□) 8-epi-tomentosin production with 2 ml/L coconut water.