Rhodotorula aurantiaca K-505로부터 Carotenoids 조성 및 생산 연구

김성근, 조대행, 김의용*

서울시립대학교 화학공학과*

Study on the composition and production of Carotenoids

from Rhodotorula aurantiaca K-505

Sung-Geun Kim, Dae-Haeng Cho, EuiYong Kim

．Department of Chemical Engineering, University of Seoul, Seoul, Korea

서론

Carotenoids는 1813년 Wackenroder가 당근의 뿌리에서 적자색 결정물인 □-carotene을 처음 발견한 이후 일련의 카로틴과 그 산화물인 크산토필을 통칭하는 의미로 통하고 있다. Carotenoids는 발색의 원인이 되는 공액 이중결합이 중복된 장쇄상의 구조를 가지고 있어, 생체에 유해한 것으로 알려진 자유라디칼(free radical)을 포집하거나 항산화 기능을 나타내는 것으로 알려져 있다[1]. 뿐만 아니라 동물의 번식촉진, 성장률 개선, 질병발생 억제, 어육의 색상 개선등 유용한 기능성을 나타내는 것으로 알려지고 있어 의약품, 사료첨가제, 건강식품 등에 이용가치가 클 것으로 기대되고 있다. Carotenoids는 일반적으로 지용성이며 공액 이중결합의 수가 많을수록 황색에서 적색으로 이행하는 것으로 알려져 있으며 불포화도가 매우 높기 때문에 열, 산, 빛, 금속이온, 과산화물, peroxidase 및 화학약품등에 쉽게 파괴되는 특징이 있다. Carotenoids의 효능으로는 비타민 A의 전구체로서 기능이 알려져 있으며 생체내에서 일중항 산소의 소거와 자유라디칼 반응의 억제기작에 의해서 발생되는 활성산소로부터 세포와 조직을 보호하는 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있다[2].

Carotenoids는 주로 식물에서 광합성의 보조색소로서 생성되며 조류(algae), 광합성 미생물, 효모 및 박테리아에서도 일부 생성된다. Carotenoids 생성 미생물로는  Duanliella sp. Phaffia sp. Haematococcus pluvialis Corynebacterium sp. Rhodotorula sp. 등이 있으며, 특히 Phaffia rhodozyma가 생산하는 astaxanthin은 상업적으로 활발히 이용되고 있다. 이처럼 미생물을 이용한 carotenoids의 생산은 빠른 성장에 기인한 경제성으로 최근 부각되고 있다.

따라서 본 연구에서는 토양에서 분리한 Rhodotorula aurantiaca K-505의  세포내 carotenoids 및 지방산의 조성을 분석하였으며 다양한 성장 조건에 따른 carotenoids의 함량 및 조성변화를 고찰하였다.

실험 방법

1.사용균주

R. aurantiaca K-505는 서울시립대학교 교정내 낙엽수 토양으로부터 분리되었으며 urease test와 nitrate reduction test를 하였고 탄소원 동화실험을 통하여 동정되었다.

2.배양

R. aurantiaca K-505로부터 Carotenoids를 생산하기 위한 배지는 glucose 10g/L, yeast extract 3g/L, peptone 5g/L을 사용하였으며, 배양은 5L jar fermentor에서 2.5L 작업용량으로 하여 통기속도 1vvm, 교반속도 150rpm, 초기 pH 6.8, 배양온도는 27℃로 48시간동안 배양하였다. 균체량 측정은 배양액을 100배 희석한후 spectrophotometer로 660nm에서 측정하였다. 그리고 소비된 당농도 측정은 시료를 10배 희석한 후 DNS 발색법으로 546nm 파장에서 흡광도를 측정하여 사전 작성한 표준 검량선에 의해 계산하였다.

3. 추출

동결건조한 균체 0.1g에 DMSO 1ml 첨가한후 질소충전시켜 상온에서 10시간 빛을 차단한채 방치하여 세포벽을 약화시켰다. acetone으로 cell이 거의 하얗게 될 때까지 추출하여 diethyl ether와 약간의 물을 첨가한후 천천히 흔들어 준다.  분리된 diethyl ether층은 증류수로 한번 세척하여 acetone을 완전히 제거한다.

4.분석

Carotenoids는 윗층인 diethyl ether층으로 이동하며 이를 -10℃에서 20분간 정치하여 용매상의 불순물을 제거한후 spectrophotometer로 흡광도를 측정하였다. 스펙트럼을 통해 얻은 □max를 구해 Davis(1976)등이 제안한 방법 [eqn: x= {Ay} over { ( { E}`_{1cm} ^{1% } TIMES 100) }] 으로 carotenoids의 총량을 구하였다.

또한 개별 carotenoids의 분리, 확인은 diethyl ether층을 40℃ 이내서 감압 농축하여 TLC상에서 분리한후 각각의 순수한 solvent에 녹여 고유의 스펙트럼을 확인한후 문헌상 고찰을 통하여 구하였다.

지방산의 조성은 메틸레이션 시킨후 GC/MS로 분석하였다. 컬럼은 HP-INNOWax를 사용하였으며 100℃부터 250℃까지 5℃/min씩 승온조작 하였다. 각각의 Carotenoids의 정량은 HPLC를 이용하여 각각의 단일 성분의 □max 값에서의 면적을 450nm에서 면적으로 환산하여 각 carotenoids 조성비를 구하여 계산하였다.

결과 및 토론

최대 비생장속도(□max)는 약 0.12[eqn: h^{-1}]로 계산되었다. 세포생장수율은 약 0.65-0.70정도로 높은 편으로 기존에 알려진 것보다 생장속도 및 수율이 높은 것으로 확인되었다(Fig.1). 성장에 따른 pH의 변화는 초기 pH 6.80에서 정상기에 이를때까지 감소하다가 정상기에 pH 4.8까지 떨어진 이후부터는 다시 약간씩 증가함을 볼수 있었다.

정상기에서의 Total carotenoids는 약 160-200□/g dry cell로 측정되었다. 이때 476nm에서 최고 흡광도를 가진다. 각각의 carotenoids 분리를 위해 TLC를 사용하였는데 이동상으로는 methanol:acetone:toluene(5:20:75)를 이용하였으며 약 2시간 정도 전개한후 냉암소에서 건조하여 Rf값을 확인하였다. 각각의 띠를 단일 solvent에 녹여 스펙트럼을 확인한 한후 문헌상 고찰을 거친결과 2개의 hydroxy기를 가진 plectaniaxanthin (3',4'-didehydro-1',2'-dihydro-□,□-carotene-1',2'-diol)이 가장 많았으며, torulene, 3개의 hydroxy기를 가진 hydroxy- plectaniaxanthin (3',4'-didehydro-1',2'-dihydro-□,□-carotene -2, 1', 2'-triol)순 이었다(Table1)(Fig.2).  Rhodotorula속에서 흔히 발견되는 □카로틴은 HPLC분석결과 극소량이 존재하였다. 즉 R. aurantiaca K-505가 생산하는 Carotenoids는 plectaniaxanthin, torulene이 주성분으로서 그외는 소량만이 존재함을 알수 있었다. 다만 carotenoids의 metabolism상 lag phase나 지수성장기에서 조성비는 이와 다를수 있을 것이다. 이러한 결과는 같은 종에 대한 연구인 Perrier등[3]의 total carotenoids 100□(g dry cell)중 55□(g dry cell)이 □-carotene이라는 결과와 매우 큰차이가 있었다.

HPLC 분석 결과로 보아 hydroxyplectaniaxanthin이 극성이 매우 큼을 알수 있었고, 다음으로는 plectaniaxanthin, torulene, □카로틴순으로 확인되었다. 또한 지방산의 조성분석결과 올레인산, 리놀레산, 팔미트산, 스테아린산 순으로 많았다. 이는 Perrier등[3]의 실험결과와 일치하는 것으로 보여진다(Fig.3).

Table . TLC analysis of carotenoids

	Rf(A:M:T=5:20:75)	color	스펙트럼(□max)
			Aceton	Ethanol
torulene	0.96-1	red	464,484,510	462,483,511
plectaniaxanthin	0.78-0.81	orange-red	452,472,502	450,473,504
hydroxyplectaniaxanthin	0.60-0.62	orange	448,472,502	448,472,503
Unknown	0.33	red	ND	ND
Unknown	0.27	red	ND	ND

참고문헌

1. Tee,R.,Robinson, R.K. and Sadler, M. J.: Encyclopedia of food science and technology. Academic Press, London, p.293(1992)

2. Krinsky, N. I.:Carotenoids protection against oxidation. Free Radical Biol.

Med., 51, 649(1979)

3. V. Perrier, E. Dubreucq, P. Galzy.: Fatty acid and carotenoid composition of Rhodotorula strains. Arch Microbiol., 164, p.173-179(1995)

Figure 2. the spectrum of  carotenoids

1) plectaniaxanthin     2)torulene

3) hydroxyplectaniaxanthin

Figure 1. The time course of cell growth, glucose conc. and pH profile

Figure 3.  The fatty acids composition of R. aurantiaca K-505

1)C3:0   2)C16:0   3)citric acid

4)C18:0  5)C18:1   6)C18:2

Figure 4. Identification of □-carotene by  HPLC/DAD spectrum